科研 |中国海大：蛋白质组学揭示太平洋牡蛎净化过程中蛋白质动态变化的分子机制（国人佳作）

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编译：微科盟-廿九，编辑：微科盟Emma、江舜尧。

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导读

太平洋牡蛎(Crassostrea Gigas)净化过程中的盐胁迫会导致品质下降；因此，有必要了解净化过程中动态变化的分子机制。我们在盐度为26~38g/L的条件下净化牡蛎72h，且产地的盐度波动范围为±10~20%，并通过顺序窗口采集所有理论质谱(SWATH-MS)来分析太平洋牡蛎的蛋白质组。在1218个蛋白质中，有241个是差异性蛋白质(DPs)。盐胁迫使得与糖酵解和细胞外基质-受体相互作用途径相关的DPs水平升高，与柠檬酸循环、脂质代谢、遗传信息处理和细胞转化相关的DPs水平降低，尤其是在暴露于38g/L盐度(+20%)的太平洋牡蛎中。在净化过程中，将盐度波动控制在生产区域的±10%范围内，有利于保持太平洋牡蛎的品质。

亮点：1.蛋白质组分析揭示了太平洋牡蛎中的差异性蛋白质(DPs)；2.与糖酵解相关的DPs水平随着盐胁迫而增加；3.与ECM-受体相互作用途径相关的DPs水平增加；4.盐度为38g/L时的净化对牡蛎质量有害；

论文ID

原名：Molecular mechanism of protein dynamic change in Pacific oyster (Crassostrea gigas) during depuration at different salinities uncovered by mass spectrometry-based proteomics combined with bioinformatics译名：基于质谱的蛋白质组学结合生物信息学揭示太平洋牡蛎净化过程中蛋白质动态变化的分子机制期刊：Food ChemistryIF：9.231发表时间：2022.06通讯作者：张鸿伟 & 薛长湖通讯作者单位：中国海洋大学

实验设计

实验结果

1. 蛋白质鉴定与定量

为了提取通过顺序窗口采集所有理论质谱(SWATH-MS)采集获得的谱图数据，我们使用来自不同盐度组样品的数据依赖型采集(DDA)数据，在95%的置信水平下，生成了太平洋牡蛎蛋白数据库：包括了62744个谱图、16543个肽段和1306个蛋白质(数据未显示)。在数据整理过程中，我们手动删除了强度较低的蛋白质，最终得到1218种蛋白质，并使用化学计量学方法进行定量和分析。

2. 蛋白质组数据概述

基于差异性蛋白质(DP)的正交偏最小二乘法判别分析(OPLS-DA)得分图表明，每个盐度处理组的样品都得到较好的分离(图1A)。此外，随着净化时间的延长，我们从左到右观察到有规律的变化。这些结果表明净化时间对太平洋牡蛎的蛋白质组有一定的影响。同时，根据蛋白质组的总体变化，来自不同盐度处理组的样品可以分成六类，这意味着净化盐度对长牡蛎蛋白质组有一定的影响(图2A)。因此，我们进一步研究了净化时间和盐度对太平洋牡蛎蛋白质组的影响。此外，来自质控(QC)样品的数据在得分图中紧密聚集，说明了超高效液相色谱-四极杆-飞行时间串联质谱技术(UHPLC-Q/TOF)平台在整个测量过程中的稳定性较好。

图1 不同时间净化后的太平洋牡蛎正交偏最小二乘判别分析(OPLS-DA)得分图
图2 不同盐度净化后的太平洋牡蛎正交偏最小二乘判别分析(OPLS-DA)得分图

在每个净化盐度组中，太平洋牡蛎的蛋白质组随着净化时间变化呈现出有规律的变化(图1B-F)。随着净化时间的延长，蛋白质组呈现从左向右的趋势。由于太平洋牡蛎的蛋白质组与净化前的样品相比有相当大的变化，72 h净化处理不利于太平洋牡蛎品质的保持。

净化24 h后，沿着t[1]的方向，暴露于10% (29 g/L)和0% (32 g/L)盐度的样品的蛋白质组聚类接近净化前的样品，而暴露于+20% (38 g/L)和-20%(26 g/L)盐度的样品的蛋白质组聚类完全分离(图2B)。净化48小时后，在t[1]的维度上，38 g/L (+20%)盐度中净化的样品的蛋白质组与其他组可完全分开(图2C)。在净化72 h后，32 g/L (0%)盐度净化的样品的蛋白质组聚类最接近净化前的样品，用26 g/L(-20%)和38 g/L(+20%)盐度净化的样品的蛋白质组聚类与对照组离得最远(图2D)。通过对三个净化时间(24、48和72h)的综合分析，我们得出结论:净化期间盐度为32 g/L的太平洋牡蛎蛋白质组发生了显著变化。相比之下，与净化前的样品相比，0% (32 g/L)和10%的盐度波动变化较小。

3. DPs的分析

我们先后进行了与OPLS-DA模型的配对比较，以筛选潜在的DPs(上调和下调)。24 h-26 g/L样品与0 h样品的比较结果用于展示DPs的筛选过程(图3)。如图3A所示，在OPLS-DA模型中，24 h-32 g/L和0 h处理的样品的DPs可被很好地分开。将S-plot中的组合|p(corr)|>0.7(图3B)、可变重要性投影(VIP)>1.0(图3C)、倍数变化(FC)>1.28或<0.83设定为DPs的标准，发现只有46种蛋白质符合。同样，我们将其他比较中符合条件的其他DPs进行组合(图3D)，发现盐度波动±20%会产生更多的DPs，且DPs的数量随着净化时间的延长而增加。

图3 应用正交偏最小二乘判别分析(OPLS-DA)模型(24 h-26 g/L vs 0 h)鉴定太平洋牡蛎DPs的实例A，OPLS-DA模型的得分图。B，OPLS-DA模型的S-plot图，DPs用红色表示。C，OPLS-DA模型的可变重要性投影(VIP)图，DPs用红色表示。D，太平洋牡蛎的DPs数量。

我们从图4也可以看出，关键蛋白的表达水平发生了变化。柠檬酸合成酶(Gi|762091605)和酮戊二酸脱氢酶(Gi|762138565)在净化24 h后的表达水平变化规律呈现先下调表达后上调表达，但在净化72 h后又开始下调表达，尤其是在盐度为38 g/L时。果糖二磷酸醛缩酶(Gi|762111259)和丙酮酸激酶(Gi|113207856)在纯化过程中呈上升趋势。乙酰CoA乙酰转移酶(gi|762121240)在净化过程中呈下降趋势；在38g/L盐度净化的样品中这一水平最低(图4B)。当净化盐度为38g/L时，谷氨酸脱氢酶(gi|762147159)和酰胺酶(gi|405956273)的表达水平显著低于盐度为32g/L的样品(图4C)。酮戊二烯酸脱氢酶(gi|762138565)在净化24 h后表达上调，而在净化24 h后表达降低。随着净化时间的延长，细胞外基质(ECM)受体相互作用相关蛋白的表达增加，当净化时的盐度波动在+20%时，表达水平最高(图4E)。

图4 不同盐度下太平洋牡蛎净化过程中差异蛋白的热图分析糖代谢；(B)脂质代谢；(C)氨基酸代谢(D)遗传信息处理；(E)环境信息处理；(F)细胞过程。

4. DPs的生物信息学分析

为了理解净化阶段的蛋白质变化，我们对DPs进行了生物信息学分析。如图5A所示，如前所述，基因本体论(GO)中存在三种注释类别:生物学过程(BP)、细胞组分(CC)和分子功能(MF)，并且这些类别包括BP的21个子类别、CC的13个子类别和MF的8个子类别。其中，代谢途径是主要途径，包括11个亚途径(图5B)。

图5 差异蛋白的生物信息学分析A，基因本体论(GO)注释分析；B，说明新陈代谢功能分类的饼状图；C，京都基因和基因组百科全书分析(KEGG)。

基于KEGG途径富集分析，四类主要途径包括代谢、遗传信息处理、环境信息处理和细胞过程(图5C)。其中，代谢是最重要的途径，包括四个亚类途径: 糖代谢、脂质代谢、核苷酸代谢和谷胱甘肽代谢。因此，KEGG途径分析总体上证实了GO注释的结果。

此外，为了充分理解在不同盐度下净化过程中太平洋牡蛎蛋白变化的特征，我们使用String v11.5数据库获得所有DPs的蛋白质-蛋白质相互作用(PPI)网络。如图6所示，PPI网络概述了DPs之间的交互作用。在所分析的183个DPs中，大多数蛋白下调表达，包括参与糖酵解、柠檬酸循环(TCA循环)、氨基酸代谢和脂质代谢等途径以及细胞过程的大多数酶。核糖体相关蛋白(rpl30、rps3a、rpl7和rps3a)、肌动蛋白相关蛋白(actb1、actb2、arpc3和actr2b)和糖代谢相关蛋白(pgm1、pgd、pdha1a、me等)都有很强的相互作用，而与氨基酸代谢相关的蛋白质(acat1、abat、glud1a和pccb)之间相互作用密切。

图6 蛋白质-蛋白质相互作用(PPI)网络的整体DPs

讨论

以往的研究表明，在盐胁迫后本研究通过对太平洋牡蛎蛋白质谱的比较分析，可以揭示调控耐盐性的分子机制。然而，很少有报道研究了在不同盐度下净化过程中调节太平洋牡蛎蛋白质变化的机制。在目前的研究中，我们使用无标记质谱技术评估了在不同盐度下净化期间和随时间推移的太平洋牡蛎蛋白质组的响应。进一步的定量蛋白质组分析显示，本研究检测到了1218种蛋白质，其中241种蛋白质被鉴定为DPs。这些DPs的功能和它们的主要途径描述如下。
1. 代谢

我们的结果表明，与几种代谢途径相关的蛋白质表达，包括糖代谢、脂质代谢、氨基酸代谢和谷胱甘肽代谢，都发生了实质性的改变，这表明净化盐度和时间影响了太平洋牡蛎的正常代谢反应。

1.1 糖代谢碳水化合物代谢的组成部分，包括糖酵解、TCA循环、戊糖磷酸途径、戊糖和葡糖醛酸的相互转化，对于太平洋牡蛎盐胁迫的响应至关重要，使它们能够迅速调整代谢过程，以提供足够的能量来应对胁迫。其中，糖酵解和TCA循环是产生ATP的主要途径。在肌肉组织中，有氧能量代谢相关蛋白表达下调是ATP生成减少的主要原因，而糖酵解代谢相关蛋白表达上调则促进无氧代谢。我们的结果表明，大多数与TCA循环相关的DPs在净化过程中下调，并且在更大的盐胁迫下更明显(图4A)。与净化前相比，与糖酵解相关的DPs表达上调，且盐胁迫越大，上调越显著。然而，当盐胁迫过高(20%)时，糖酵解的促进作用减弱。如图所示，柠檬酸合酶(gi|762091605)和酮戊二酸脱氢酶(gi|762138565)是过程中的关键酶，在净化24小时后下降，然后上升，但在净化72小时后，它们的水平下降，特别是在盐度为38g/L时。糖酵解中的两种关键酶，果糖二磷酸醛缩酶(gi|762111259)和丙酮酸激酶(gi|113207856)的水平在净化过程中呈上升趋势，表明糖酵解可能得到增强；然而，过高的盐胁迫延缓了这种效应。这与我们以前检测糖酵解酶活性的结果一致。此外，对于其他糖代谢相关的途径，如甘露糖代谢、半乳糖代谢、丙酮酸代谢、乙醛酸和二羧酸代谢、丙酸代谢和丁酸代谢途径，大多数相关蛋白质的水平随着净化时间的推移呈下降趋势，这表明太平洋牡蛎在净化过程中会消耗碳水化合物，特别是在20%盐度胁迫组中。
1.2 脂质代谢已知脂肪酸在太平洋牡蛎应对压力的能量供应中发挥作用。基于这里的KEGG结果，一些DPs在脂肪酸代谢途径中富集(图4B)。在脂肪酸代谢过程中，电子转移通过线粒体呼吸链进而促进ATP的合成，并产生乙酰辅酶A(乙酰CoA)。乙酰CoA通过TCA循环代谢产生二氧化碳，进一步实现储能。如图4B所示，乙酰CoA酰基转移酶(gi|762121240)在净化过程中表现出下降的趋势；盐度为38g/L的样品中乙酰CoA酰基转移酶的含量最低。这表明，在高盐度和相对长的时间净化可能会导致太平洋牡蛎脂肪酸代谢的下降，这与我们以前对脂肪酸组成的研究结果一致。
1.3 氨基酸代谢氨基酸代谢对太平洋牡蛎的生长、发育和盐度胁迫反应具有重要意义。当前研究的KEGG结果表明，与丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢，缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸降解，色氨酸代谢相关的蛋白质被显著富集(图4C)。净化72 h时，大部分与氨基酸代谢相关的DPs呈下降趋势，尤其是当盐度为38 g/L时，说明净化时间和盐度对太平洋牡蛎的氨基酸代谢有显著影响。例如，谷氨酸脱氢酶(gi|762147159)是丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢途径中的一种重要酶，催化氨基酸分解产生氨。具有潜在毒性的氨以谷氨酰胺的形式转运到排泄部位，在那里被酰胺酶水解释放出游离氨，并通过扩散从体内排出。在此，我们发现当净化盐度为38 g/L时，谷氨酸脱氢酶(gi|762147159)和酰胺酶(gi|405956273)的表达水平显著低于净化盐度为32 g/L时的样品，这可能导致高盐净化后太平洋牡蛎的氨产量显著降低。这些结果与我们以前关于氨排泄率的结果一致。除了组成蛋白质，氨基酸作为代谢的中间产物也起着重要的作用。蛋白质中发现的20种氨基酸具有广泛的化学多样性。然而，氨基酸代谢并不独立于碳代谢。这项研究中氨基酸水平的变化与碳水化合物代谢有关，包括TCA循环。例如，在氨基酸代谢和葡萄糖代谢中常见的DP如酮戊二烯酸脱氢酶(gi|762138565)的水平在净化24 h后降低，然后升高，这表明在净化24 h后，太平洋牡蛎的适应性增强，糖异生作用加强。然而，在净化72h后，蛋白质的表达下降，尤其是在盐度为38g/L的净化样品中。对此的一种解释是过长的净化时间(72 h)影响了太平洋牡蛎的糖异生活性，这将验证我们先前的结论，即长净化时间和高净化盐度导致太平洋牡蛎的过度应激和品质下降。
2. 遗传信息处理
以前的蛋白质组学研究表明，基因表达相关的蛋白质，以及参与蛋白质合成、折叠和修饰的蛋白质等对应激条件有反应。基因表达涉及转录后调节和翻译后修饰。本研究鉴定了30个与遗传信息处理相关的DPs，包括6个40S核糖体亚单位蛋白(40S核糖体蛋白SA、S28、S8、S13、S26)和8个60 s核糖体蛋白(60S酸性核糖体蛋白P2、L18a、L28、l27a亚型x1、L7、L30)、一种翻译起始因子(真核翻译起始因子3亚基蛋白)、三种糖基转移酶。核糖体由核糖体RNA和核糖体蛋白质组成，是负责蛋白质合成的重要细胞器。核糖体蛋白在蛋白质合成、DNA复制、转录、损伤修复和细胞生长调节中起重要作用。本研究鉴定了大多数核糖体相关蛋白，表明盐胁迫通过诱导细胞核中核糖体蛋白的表达影响蛋白质合成。在盐胁迫下，这些蛋白质中的大多数的表达下调，特别是在20%胁迫组的样品中(图4D)，这与盐胁迫可以部分抑制蛋白质合成的结论一致。总之，各种蛋白质表达模式表明，蛋白质自我调节系统是太平洋牡蛎适应盐胁迫的关键。
3. 环境信息处理
通过KEGG富集分析，我们富集了ECM受体相互作用这一过程，并鉴定了7种蛋白质；这一过程已被证明可防止细胞凋亡。如图4E所示，随着净化时间的延长，ECM-受体相互作用相关蛋白的表达量增加，当净化盐度在生产区域的+ 20%波动时，表达量最高。这表明在盐胁迫处理后，与抑制和调节细胞凋亡相关的ECM受体和蛋白质之间的相互作用通常以不同的方式上调。因此我们推测，太平洋牡蛎可能利用细胞外基质-受体相互作用信号通路来防止细胞凋亡和适应盐度的变化。
4.  细胞过程
胞吞和吞噬是太平洋牡蛎重要的免疫保护机制。吞噬作用是生物体内最古老、最基本的细胞防御机制之一，由细胞表面的模式识别、细胞内吞噬体的形成和成熟等一系列关键事件组成。肌动蛋白的调节是吞噬作用完成的重要步骤。在受体参与吞噬过程之前，肌动蛋白处于“静止”阶段。肌动蛋白聚合是促进膜运动和吞噬体形成的驱动力。我们发现吞噬体途径在本研究中通过净化得到了富集，并且我们筛选出了7个与吞噬体相关的蛋白作为DPs，包括肌动蛋白和微管蛋白β链。这些蛋白质的表达在净化过程中减少(图4F)。盐胁迫越大，这些蛋白质下降越显著，说明在净化过程中应对盐胁迫时，太平洋牡蛎开始发生吞噬，这可能是为了免疫保护；盐胁迫越大，太平洋牡蛎在自我保护方面受到的压力就越大。

结论

本研究从蛋白质水平上分析了净化盐度对太平洋牡蛎品质的影响。我们总共鉴定了1306种蛋白质，其中我们定量了1218种蛋白质，筛选出241种DPs，过高的盐胁迫导致更多的DPs形成。同时，净化时间的延长也导致了更多的DPs。对DPs的生物信息学分析表明，过度的盐胁迫增加了与糖酵解和ECM-受体相互作用途径相关的蛋白质表达，而在相关的代谢过程如TCA循环和脂质代谢中，以及在遗传信息处理(翻译、折叠、分类和降解)和细胞转化(内吞作用和吞噬体)中蛋白质表达则降低。生产区域20%的盐度波动会导致蛋白质的表达水平发生波动。因此我们得出结论，在净化过程中，盐度波动应控制在生产区域的10%以内，以保持太平洋牡蛎的质量。这项研究的结果将在分子水平上扩展在盐度波动中我们对牡蛎质量影响的认识，为改善净化过程中牡蛎质量下降和加强牡蛎产业提供潜在的实用方法。原文链接：  

https://doi.org/10.1016/j.foodchem.2022.133454

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