科研 |北京中医药&内蒙古民族：基于蛋白质组学和生物信息学揭示中药复方改善缺血性脑卒中的机制（国人佳作）

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编译：微科盟-草重木雪，编辑：微科盟Emma、江舜尧。

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导读

扎冲十三味丸（ZSP）是一种常用的治疗脑血管疾病的蒙药，对缺血性脑卒中（IS）的临床治疗有一定作用。在确定ZSP对脑缺血保护作用的基础上，本研究采用蛋白质组学方法探讨ZSP对IS的作用机制。我们采用金属丝栓塞法构建大鼠大脑中动脉栓塞(MCAO)模型，分为假手术组、模型组、ZSP组高剂量组、中剂量组、低剂量组、阳性药物对照组。造模后12 h采集大鼠脑组织。神经功能缺损评分和脑梗死体积比被用于评价药效学，为后续实验选择最佳剂量。我们采用蛋白质组学方法筛选出可能的ZSP抗IS介导途径和相关差异蛋白；利用网络药理学验证疾病与药物之间的相关性；采用苏木精-伊红(HE)和透射电镜(TEM)进一步研究ZSP抗IS的药效学作用及其可能机制。大鼠脑梗死率及神经功能评分均显示ZSP中剂量组疗效最佳。蛋白质组学结果表明，ZSP的抗IS作用主要通过溶酶体途径进行。LAMP2、AP3M1和SCARB2是该通路的差异蛋白。网络药理学证实了这一点。HE染色和TEM结果显示，ZSP能改善MCAO大鼠神经元的病理状态，减少MCAO大鼠溶酶体的数量。免疫印迹(WB)结果显示，与模型组比较，ZSP组LAMP2、AP3M1蛋白表达水平明显下调，SCARB2蛋白表达水平明显上调。本研究证实ZSP调节溶酶体通路，可能通过下调LAMP2、AP3M1和上调SCARB2来保护IS。

亮点：1. ZSP对脑缺血有药理作用；2. 本研究将蛋白质组学与生物信息学相结合；3. ZSP可能调节溶酶体途径；4. ZSP通过影响多种蛋白改善脑缺血。

论文ID

原名：Zhachong Shisanwei Pill resists ischemic stroke by lysosome pathway based on proteomics and bioinformatics译名：基于蛋白质组学和生物信息学揭示扎冲十三味丸通过溶酶体途径改善缺血性脑卒中期刊：Journal of EthnopharmacologyIF：5.195发表时间：2022.09通讯作者：刘欣 & 白梅荣通讯作者单位：北京中医药大学 & 内蒙古民族大学

实验设计

实验结果

1. ZSP的HPLC结果
本研究通过测定没食子酸、cocolactone、dehydrocostlactone和甘草苷的含量来验证ZSP的疗效。如图1所示，它们分别代表没食子酸、木香烃内酯、dehydrocostlactone和甘草苷四种标准产物。没食子酸、dehydrocostlactone和木香烃内酯标准品的峰面积分别为1 962.338、742.611、818.215，甘草苷的峰面积为7201.267。样品中没食子酸、dehydrocostlactone和木香烃内酯的峰面积分别为1147.983、670.931和475.345，甘草苷的峰面积为183.799。结果表明，ZSP中没食子酸、木香烃内酯、dehydrocostlactone和甘草苷的含量分别为0.293 mg/mL、0.290 mg/mL、0.452 mg/mL和12.762mg/ mL。表1 鼠排除标准表
图1 (A)没食子酸、dehydrocostlactone和木香烃内酯标准品的高效液相色谱结果；(B)甘草苷标准品的高效液相色谱结果；(C) ZSP样品中没食子酸、dehydrocostlactone和木香烃内酯的高效液相色谱结果；(D) ZSP样品中甘草苷的HPLC测定结果。
2. ZSP对MCAO大鼠脑缺血损伤有改善作用
图2为不同剂量组蒙药ZSP改善MCAO大鼠的脑梗死图。与假手术比较，模型组梗死体积比明显升高(n = 10, 24.18%±5.14% vs. 0.00%±0.00%，P < 0.001)。ZSP高剂量组(n = 10, 17.30%±3.19% vs. 24.18%±5.14%，P < 0.001)、ZSP中剂量组(n = 10, 9.59%±4.33% vs. 24.18%±5.14%，P < 0.001)、ZSP低剂量组(n = 10, 16.84%±4.09% vs. 24.18%±5.14%，P < 0.001)以及阳性药物对照组(n = 10, 13.19%±3.31% vs. 24.18%±5.14%，P < 0.001)均具有一定程度上的改善作用，其中ZSP中剂量组疗效优于ZSP高剂量组和ZSP低剂量组。结果显示，与假手术组比较，模型组神经功能评分明显降低(n = 10, 2.80±0.42 vs 0.00±0.00, P < 0.001)，说明模型组出现明显的肢体偏瘫、旋转等神经功能缺损症状。与模型组比较，低剂量组(n = 10, 2.10±0.74 vs. 2.80±0.42,P < 0.05)、中剂量组(n = 10, 1.80±0.42 vs. 2.80±0.42,P < 0.001)和阳性药物对照组(n = 10, 1.90±0.74 vs. 2.80±0.42,P < 0.01)大鼠神经功能明显改善。ZSP高剂量组差异无统计学意义(n = 10, 2.40±0.84 vs. 2.80±0.42,P > 0.05)。综上所述，ZSP能显著降低MCAO模型大鼠的脑梗死体积比和神经功能评分。各剂量组均有治疗脑缺血的效果，以中剂量组效果最好，作为后续实验的最佳剂量组(补充表S1)。图2 (A)大鼠MCAO模型TTC染色结果，白色为梗死区，红色为非梗死区；(B) ZSP对MCAO大鼠脑梗死体积比的影响；(C)大鼠神经功能评分结果。与假手术组比较，*P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001；与模型组比较，△P < 0.05，△△P < 0.01，△△△P < 0.001。
3. ZSP改善MCAO大鼠脑缺血的蛋白质组学
我们在图3中展示了蛋白质组学分析的结果。蛋白质组学数据显示，共鉴定的多肽数为51 052个，鉴定的蛋白质数为4 248个。由于样本的重复次数大于等于3次，所以直接采用t检验进行差异分析。P < 0.05和倍数变化 > 1.2的蛋白被认为是差异表达蛋白。与假手术组比较(n = 4)，模型组筛选出差异表达蛋白196个，其中上调表达蛋白98个，下调表达蛋白98个。与模型组比较，ZSP-M组筛选出差异表达蛋白180个，其中上调表达蛋白53个，下调表达蛋白127个。差异蛋白的KEGG富集分析结果以气泡图的形式显示了前20条通路，发现ZSP调节的差异蛋白参与抗脑缺血相关通路主要包括：溶酶体、生物素代谢、系统性红斑狼疮、维生素B6代谢、胰腺分泌等。溶酶体通路与ZSP抗脑缺血作用的相关性最高。我们通过通路图筛选出与ZSP抗脑缺血作用相关的差异蛋白为LAMP2、AP3M1和SCARB2。图3 (A)模型组与假手术组差异蛋白火山图；(B) ZSP组与模型组差异蛋白火山图；(C)模型组与假手术组KEGG通路气泡图；(D) ZSP组与模型组KEGG通路气泡图；(E)模型组和假手术组溶酶体通路图；(F) ZSP组和模型组溶酶体通路图。在通路图中，红色代表上调的差异蛋白，深绿色代表下调的差异蛋白。
4. 生物信息学证实ZSP可改善溶酶体通路和脑缺血
生物信息学分析结果如图4所示。在口服生物利用度(OB)≥30%、类药性(DL)≥0.18的条件下，我们从HIT2.0、TCMSP和HERB数据库中筛选出ZSP有效成分的靶标1 036个。脑缺血性卒中疾病的靶点有942个。Genecards共获得2 917个溶酶体靶点。我们获得ZSP活性成分靶点、IS疾病靶点和溶酶体靶点的交集，得到了ZSP与IS的340个交叉靶点，ZSP与溶酶体的432个交叉靶点，IS与溶酶体的413个交叉靶点。我们再次从上面的交集中共得到195个靶点，通过Degree value筛选得到关键靶点JUN、STAT3、MAPK3、AKT1、MAPK1、TP53、SRC、CTNNB1、PTPN11和ESR1。综上所述，ZSP抗脑缺血的作用机制确实与溶酶体通路有关，具体机制需要结合蛋白质组学结果筛选出的差异蛋白，并通过实验验证。靶点见补充表S2。图4 (A) ZSP活性成分靶点、IS疾病靶点和溶酶体靶点的交集维恩图；(B) ZSP活性成分靶点、IS疾病靶点和溶酶体靶点的PPI；(C) ZSP活性成分靶点、IS疾病靶点和溶酶体靶点的核心靶点。
5. ZSP可改善MCAO大鼠神经元的病理形态
各组大鼠大脑组织形态学结果如图5所示。大鼠脑组织HE染色结果显示，假手术组(n = 3)大鼠脑神经元形态正常，轮廓清晰，圆润饱满，细胞质染色均匀。细胞核位于细胞中央，脑组织纹理清晰。MCAO模型建立后，大鼠大脑神经元发生不同程度损伤，神经元萎缩、轮廓模糊，胞质染色深，细胞核与胞质边界不清，脑组织结构紊乱，明显不同于正常组织。与模型组比较，ZSP组大鼠病理改变较少，部分神经元轮廓清晰，呈现轻度恢复状态。这些结果表明，ZSP具有减轻神经元损伤和保护神经元的作用。为了研究ZSP对溶酶体通路的影响，透射电镜观察了溶酶体的变化。结果显示，与模型组比较，MCAO 12 h后ZSP-M和金纳多组溶酶体数量增加，而溶酶体数量减少(n = 3, P < 0.001)。说明脑缺血12 h后溶酶体的正常生理功能被破坏，ZSP可缓解溶酶体的功能障碍。图5 (A)各组大鼠脑组织形态HE染色结果；(B)各组大鼠脑组织溶酶体变化TEM结果；(C)透射电镜下各组大鼠脑组织神经元胞质溶酶体数量。与sham组比较，*P < 368 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001；与模型组比较，△P < 0.05，△△P < 0.01，△△△P < 0.001。
6. ZSP介导溶酶体途径，调节LAMP2、AP3M1和SCARB2
WB结果如图6所示。与假手术组比较，模型组LAMP2、AP3M1蛋白相对表达量显著升高(n = 3, P < 0.05, P < 0.01)， SCARB2蛋白相对表达量显著降低(n = 3, P < 0.05)。与模型组比较，ZSP-M组大鼠LAMP2、AP3M1相对蛋白表达量显著降低(n = 3, P < 0.01, P < 0.05)，模型组大鼠SCARB2相对蛋白表达量显著升高(n = 3, P < 0.05)。图6 各组脑组织相对蛋白表达量β-肌动蛋白是一种内参蛋白。(A) LAMP2、AP3M1、SCARB2和β-actin的WB条带。(B) LAMP2、AP3M1和SCARB2相对于β-actin的蛋白表达水平。与假手术组比较，*P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001；与模型组比较，△P < 0.05，△△P < 0.01，△△△P < 0.001。

讨论

ZSP是植物药、动物药和矿物药的组合。具有祛风、健肌活血、镇静安神的作用，临床上常用于心脑血管疾病的治疗。研究表明，诃子成分没食子酸可以通过抗炎、抗氧化作用治疗缺血性脑卒中，还可以抑制运动功能障碍，提高学习能力，保护神经元不受损伤。研究表明草乌生物碱对大鼠局灶性脑缺血有保护作用，可改善神经行为障碍，减少脑梗死体积，减轻pMCAO大鼠脑水肿。药理研究表明，丁子香色酮通过FOXO3a/NF-κB通路在大鼠脑缺血-再灌注损伤中发挥神经保护作用。同时，肉豆蔻的成分肉豆蔻木脂素对慢性缺血引起的脑组织损伤具有调节作用。石菖蒲的成分α-asaryl ether对脑缺血再灌注损伤具有显著的保护作用，其作用机制主要是通过调节ROS活性和抑制NF-κ b磷酸化作用，从而减少NLRP3炎症小体的过度激活，通过抗炎作用保护脑缺血再灌注损伤。木香成分木香烃内酯促进Nrf2激活，保护神经免受氧化损伤，通过维持正常水平的ROS和总硫醇(total thiols)，恢复细胞氧化还原稳态。甘草的成分甘草苷能抑制氧化应激，维持血脑屏障的完整性，促进细胞增殖、迁移和血管生成，减少细胞凋亡。动物药麝香中麝香酮可通过激活PI3K/Akt信号通路促进神经干细胞增殖分化，恢复神经元缺血损伤。珊瑚可影响血液流变学，药理研究表明，红珊瑚可降低血瘀大鼠全血和血浆粘度，增加NOS含量，减轻血管损伤。本研究显示ZSP能显著降低脑梗死体积比和神经功能评分，说明ZSP对缓解肢体运动障碍更有效，具有神经保护作用。本研究的蛋白质组学结果提示ZSP可能通过溶酶体途径发挥抗脑缺血作用。溶酶体作为细胞和内部环境平衡的调节中心，可对不同的环境刺激作出反应，发挥多种溶酶体信号通路，维持细胞内稳态。例如，溶酶体细胞的溶质表面与营养调节蛋白复合物动态相关。营养传感器和生长因子信号调节剂，包括mTORC1，调节溶酶体生物发生的转录因子TFEB。溶酶体Ca²⁺释放调节各种细胞过程的诱导，包括内体-溶酶体融合TFEB核易位、自噬体-溶酶体融合和溶酶体胞外分泌。已有研究发现，脑疾病与溶酶体功能障碍相关，可导致神经功能障碍和病理改变，如钙信号缺陷、自噬流受损、星形胶质细胞增殖、小胶质细胞激活等，通过TFEB和下游效应子或mTORC1的溶酶体调节改善脑疾病的神经症状。研究表明TEEB介导的快速、短暂溶酶体增大，成膜可介导溶酶体通透性，调节自噬，促进神经毒性错折叠蛋白的清除，达到神经保护作用。Ca²⁺介导的钙蛋白酶活化和活性氧生成可导致溶酶体膜破裂，诱导组织蛋白酶B、L、D释放，导致缺血性神经元损伤。研究表明，组织蛋白酶D的缺失可导致中风期间溶酶体功能障碍，导致蛋白质聚集增加，并导致中风期间细胞死亡。通过药物干预维持组织蛋白酶D活性可以改善溶酶体功能，保护大脑免受中风诱导的细胞死亡。在本研究中，网络药理学分析结果也证实了ZSP抗脑缺血与溶酶体通路有关。IS的主要病理改变是脑梗死，主要是脑血循环障碍、缺血缺氧引起局部脑组织坏死或软化，进而产生相应的神经功能缺陷。当脑组织血流不足时，神经元等脑细胞的供氧、供糖就会减少。然后会触发各种生理、生化、分子机制，如膜功能障碍、活性氧产生、钙流入的兴奋性毒性等，导致细胞死亡。广泛的脑细胞死亡可改变基本的神经功能，并产生炎症反应，导致血脑屏障的通透性增加。溶酶体是一种单膜细胞器，在水解酶作用下，通过胞内/吞噬作用将胞内、胞外物质降解为小分子，维持细胞正常的生理代谢。因此，维持细胞内环境的稳态需要溶酶体膜的完整和正常功能。在特定条件的刺激下，可破坏溶酶体膜的完整性，导致溶酶体膜通透性(LMP)，溶酶体中所含的组织蛋白酶可释放到细胞质中，激活caspase，导致细胞凋亡。此外，溶酶体可以通过自噬介导细胞凋亡，它在引导细胞存活方面起着双重调节作用。细胞自噬是细胞老化或多余的受损部分被吞食，蛋白质和细胞器降解或消化，在各种细胞在应激调节的条件下达到生态平衡，使细胞更有利于生存，但当自噬使细胞蛋白质和细胞器过度消耗时，细胞就无法生存，即发生凋亡。研究表明，自噬通过组织蛋白酶D的成熟，触发caspase 3的裂解和激活，从而诱导细胞凋亡。同样，溶酶体也参与脑缺血诱导的细胞凋亡。当脑缺血发生时，会发生氧化应激，导致溶酶体膜不稳定，损伤或破裂。容易发生LMP，水解酶会扩散到细胞质中。溶酶体中的Caspase在脑缺血损伤过程中可作为凋亡诱导物，促进神经元凋亡。因此，溶酶体在IS中起着至关重要的作用。He染色和TEM结果显示大鼠体内溶酶体数量明显增加，而ZSP和金纳多则减少溶酶体数量。这证实了溶酶体的关键作用。本研究表明，在溶酶体途径中，LAMP2、AP3M1和SCARB2是与ZSP抗IS作用相关的差异蛋白。溶酶体相关膜蛋白2 (LAMP2)是一种高度糖基化的蛋白质，是溶酶体膜的主要蛋白质成分，与LAMP1一起占溶酶体膜中所有蛋白质的50%。其具有维持溶酶体膜和溶酶体腔结构完整的作用。LAMP2可调节溶酶体胆固醇转运，调节自噬体和吞噬体成熟。LAMP2缺失导致吞噬小体成熟缺陷，溶酶体蛋白酸化和向吞噬小体募集严重受损，导致细胞杀伤能力下降。此外，LAMP2缺乏还可导致自噬液泡积累增多、溶酶体外观改变和胆固醇代谢障碍。一些研究曾将LAMP2作为溶酶体标记物，结果显示，pMCAO和OGD损伤后星形胶质细胞内溶酶体数量增加，LAMP2水平明显升高。研究发现，敲除小鼠大脑中的LAMP2会导致炎症、运动和学习障碍。可能的原因是LAMP2缺失引起的海马神经元溶酶体活性的改变、p62阳性聚集物的明显积累、海马功能障碍中的自噬液泡和脂质储存。清道夫受体B类成员2 (SCARB2)是一个编码溶酶体整体膜蛋白2 (LIMP2)的蛋白质编码基因。它是一种III型跨膜糖蛋白，存在于溶酶体和核内体的界膜上，是维持溶酶体和核内体正常生物发生所必需的。LIMP2可将内质网(ER)的溶酶体蛋白葡萄糖苷酶(GCase)通过高尔基体系转运到细胞降解的溶酶体；此外，LIMP2还具有通过其腔体将胆固醇运输到溶酶体膜的功能，并参与溶酶体脂质运输。研究表明SCARB2是一种在多种组织中表达的进化保守基因，包括大脑。此外，SCARB2突变被认为是肌阵挛-肾衰竭综合征(AMRF)的发病机制，表现为肾脏或神经系统特征，SCARB2编码的蛋白质LIMP2缺失与神经系统异常和肾功能衰竭有关，并作为酸性葡萄糖脑苷脂酶受体，影响帕金森氏症。接头相关蛋白复合体3亚基Mu 1(AP3M1)是AP-3接头复合体的一个亚基，促进高尔基膜囊泡的萌发，并可能参与到溶酶体的转运。有了BLOC 1复合物，AP-3就需要靶向物聚集在细胞体上的囊泡，以便传递到神经突和神经末梢。AP-3在整个大脑，特别是纹状体和海马区表达，主要位于突触前轴突区。研究发现，神经元AP-3亚基的改变主要引起神经缺陷。AP-3在神经元中过表达会导致单个囊泡中神经递质含量降低，而AP-3的缺失则会增加神经递质含量。AP-3位于跨高尔基网络和可能未成熟的分泌泡内。它可能参与神经分泌囊泡的形成和调节神经递质的释放。以上文献研究与本研究WB结果一致。本研究讨论的溶酶体相关机制如图7所示。图7 ZSP改善IS的溶酶体相关机制

结论

本研究通过蛋白质组学和生物信息学，证实了ZSP在动物模型体内介导溶酶体通路，可能通过下调LAMP2、AP3M1和上调SCARB2对神经元起到保护作用，为后续研究提供了证据。然而，本研究仅限于体内动物模型，未涉及临床试验。未来还需要进行临床试验，以更好地证明该药的疗效和作用机制。

原文链接：  https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/36183948/

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