科研 |海军军医大学：KAT7介导的乙酰化修饰调控肝癌新机制(国人佳作)

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编译：微科盟，编辑：微科盟Emma、江舜尧。

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导读

肝癌的发生经历了肝癌祖细胞(HcPCs)转变为肝癌细胞的过程，而驱动HcPCs发展的机制在很大程度上仍是未知的。在二乙基亚硝胺诱导的肝癌（Hepatic cell carcinoma，HCC）小鼠模型中，我们利用定量质谱的方法对非聚集性肝细胞群和HcPCs聚集群进行蛋白质组学分析，揭示了HcPCs中的失调蛋白。肝癌前体细胞HcPCs中异三聚体G刺激蛋白α亚基(GαS)蛋白水平显著升高，促进其对致癌和促炎细胞因子IL-6的应答，并驱动癌前HcPCs转化为肝癌细海军军医大学胞。机制上，在IL-6的刺激下，HcPCs细胞膜上的GαS的K28位点被赖氨酸乙酰转移酶7(KAT7)乙酰化，引起由酰基蛋白硫酯酶1介导的GαS去棕榈酰化及其胞质易位，这些可用模拟GαS去乙酰化的K28A或模拟乙酰化突变的K28Q小鼠和肝脏Kat7敲除小鼠来验证。然后，细胞质乙酰化的GαS与信号转导和转录激活因子3(STAT3)相关联，阻碍其与细胞信号转导抑制因子3互作，从而以前馈的方式促进HcPCs中STAT3的磷酸化和对IL-6的应答。临床上发现GαS，特别是k28 -乙酰化的GαS，在人肝癌前异常增生结节中升高，且与STAT3磷酸化增强呈正相关，这与小鼠模型中得到的数据一致。因此，HcPCs的恶性进展需要k28乙酰化和细胞质易位的GαS的增加，从而增强对IL-6的应答，并驱动癌前HcPCs转为HCC，这为预防肝癌发生提供了机制上的见解和潜在的靶点。

论文ID

原名：Malignant progression of liver cancer progenitors requires lysine acetyltransferase 7–acetylated and cytoplasm-translocated G protein GαS译名：肝癌祖细胞的恶性进展需要赖氨酸乙酰转移酶7-乙酰化的及胞质易位的G蛋白GαS期刊：HepatologyIF：17.298发表时间：2022.04通讯作者：侯晋 & 曹雪涛通讯作者单位：海军军医大学免疫学研究所暨医学免疫学国家重点实验室

实验设计

实验结果

1. 在癌前HcPCs中，GαS蛋白水平升高，并促进肝癌的发生

为了鉴定HcPCs中的异常蛋白，我们使用基于串联质量标记(TMT)的定量蛋白质组学技术检测了DEN治疗5个月后小鼠肝脏中非聚集肝细胞和含有HcPCs的聚集群之间的蛋白水平差异，发现了8个一致上调的蛋白(变化大于2倍)和8个一致下调的蛋白(变化小于0.5倍)(图1A;图S1A)。在持续上调的蛋白中，有一些被认为具有促肿瘤功能，如claudin 3和溶质载体家族6成员12能促进卵巢癌的进展，而溶质载体家族1成员2 (SLC1A2)可形成CD44 -SLC1A2融合转录本促进胃癌肿瘤生长。GαS蛋白水平在聚集物中增加最显著(图S1A)，表明其在HcPC进展和肝癌发生中发挥潜在作用。为了确定HcPC的特征，我们检测了HcPC标志物的表达，包括细胞表面分子Cd44、淋巴细胞抗原6家族成员D (Ly6d)、祖细胞标记物上皮细胞粘附分子(Epcam)、人肝癌标志物甲胎蛋白(Afp)和STAT3磷酸化，这些在HcPCs中均显著升高(图S1B,C)。我们随后证实，与非聚集肝细胞相比，HcPCs中GαS蛋白水平升高，而GαS mRNA水平未发生改变(图1B;图S1D)。因此，这些数据表明，在HcPCs中GαS蛋白水平升高，可能参与其恶性进展。

随后我们探讨了HcPCs中GαS蛋白水平升高的机制。在HcPCs中，GαS蛋白水平而非mRNA水平的升高表明GαS蛋白水平的升高发生在转录后调控过程中。由于microRNA (miRNA)是最重要的转录后调控因子之一，一些异常调控的miRNA已被证实可促进HCC的发展，我们推测它们在HcPCs中的异常调控可能是GαS增加的原因。因此我们检测了丰富的肝脏miRNA，包括miR-122、miR-192、miR-199a-3p、miR-101、let-7a、miR-99a和miR-143，我们发现只有miR-143直接靶向GαS mRNA(图S1E,F)。转染miR-143模拟物或抑制剂后，肝细胞细胞系中GαS蛋白水平分别降低或增加(图S1G)，但不影响GαS mRNA水平(图S1H)。HcPCs中miR-143的表达也降低(图S1I)。总之，这些结果表明miR-143表达的降低是HcPCs中GαS蛋白水平升高的原因。

为了阐明GαS增加在HcPCs恶性进展中的潜在作用，我们构建了在肝细胞中特异过表达GαS的小鼠(GαS^hep+/+)(图1C, D;图S1J)。GαS^hep+/+小鼠看起来很正常，肝脏重量与体重之比与对照组小鼠相似，我们在老年GαS^hep+/+小鼠中没有检测到自发性肝肿瘤(数据未显示)。DEN诱导肝癌发生的小鼠模型模拟了炎症诱导的HCC并再现了雄性小鼠比雌性小鼠的发病率更高，利用这个模型我们发现DEN 注射8个月后与对照组雄鼠相比，GαS^hep+/+雄性小鼠的肝癌发生显著加剧，肿瘤发病率、数量和大小都增加 (图1E,F)。相比之下，雌性GαS^hep+/+小鼠的肝癌发生与对照组小鼠相似(图1F)。这些数据表明，肝细胞中GαS的增加只在雄性小鼠中促进肝癌的发生。此外，我们还构建了GαS肝细胞特异性敲除小鼠(GαS^{hep- /-})(图1G, H;图S1K)。与对照组相比，GαS^{hep -/-}雄性小鼠的肿瘤发生率、数量和大小显著降低，但雌性小鼠没有变化(图1I, J)。这些数据表明，GαS蛋白水平在肝癌前体细胞HcPCs中升高，且肝脏GαS蛋白水平的升高促进了雄鼠肝癌的发生。

图1 GαS蛋白水平在癌前HcPCs中升高，促进肝癌发生(A)TMT评估肝脏聚集物和非聚集物之间差异表达蛋白比较的结果，这是初次DEN注射5个月后四组雄鼠的结果。(B) western blot检测正常肝细胞、非聚集肝细胞、HcPCs和HCC组织中GαS蛋白水平。(C)RT-PCR定量分析GαS^F/F(OVER)和GαS^hep+/+小鼠肝脏中GαS mRNA的表达(n = 3，非配对t检验)。(D)免疫印迹检测GαS在GαS^F/F(OVER)和GαS^hep+/+小鼠肝脏中的表达。(E) DEN诱导GαS^F/F(OVER)和GαS^hep+/+小鼠HCC的代表性肝脏图示。(F)对(E)中的肿瘤发生率(卡方检验)、肿瘤数目和最大直径(未配对t检验)进行分析(n = 12)。（G）定量RT-PCR检测GαS^{F /F(KO})和GαS^{hep -}小鼠肝脏中GαS mRNA的表达(n = 3，未配对t检验)。(H) western blot法检测GαS在GαS^F/F(KO)和GαS^{hep -/-}小鼠肝脏中的表达。(I) DEN诱导GαS^F/F(KO)和GαS^{hep- /-}小鼠HCC的代表性肝脏。(J)分析(I)中的肿瘤发生率(chisquar检验)、数目和最大直径(未配对t检验)(n = 12)。数据显示为均值±标准差，图像为三次独立实验的一个代表性图像。*p < 0.05, **p < 0.01

2. GαS依靠IL-6来促进肝癌的发生

我们进一步研究了GαS的增加促进肝癌发生的潜在机制。DEN诱导肝损伤后，血清谷丙转氨酶和天冬氨酸转氨酶水平在对照组和GαS^hep+/+雄性小鼠之间相似(图S2A)。其次，由于由坏死或凋亡的肝细胞诱导的促炎细胞因子IL-6在DEN诱导的雄性小鼠的肝癌发生中起着关键作用，并且肝GαS过表达仅促进了DEN诱导的雄性小鼠肝癌发生，我们假设GαS促进肝癌的发生依赖于IL-6。

然后，我们构建了GαS^hep+/+IL6^-/-和GαS^hep+/+IL6ra^hep-/-小鼠，结果发现IL-6缺失减少了DEN诱导的肝癌，而GαS^hep+/+II6^-/-雄性老鼠和II6^-/- 雄性老鼠显示出类似的DEN诱导的HCC的减少(图2A)，表明肝IL-6缺失时肝GαS过表达并不能促进肝癌发生。同样地，GαS^hep+/+IL6ra^{hep -/-}雄性小鼠的肝癌发生降低与肝IL-6受体敲除(Il6ra^{hep -/-})雄性小鼠相似(图2B)。因此，肝GαS促进肝癌的发生依赖于促炎细胞因子IL-6。

由于miR-143的降低介导了HcPCs中GαS蛋白水平的升高，我们也构建了miR-143敲除(miR-143 ^-/-)小鼠(图S2B,C)，并证实了miR-143缺乏增加了肝脏GαS蛋白水平，而非mRNA水平 (图S2D,E)。在miR-143 ^-/-雄性小鼠中也观察到增强的DEN诱导的肝癌发生，这依赖于IL-6(图S2F)，进一步证实了由miR-143减少所介导的GαS的增加促进了IL-6介导的和炎症诱导的肝癌发生。

然后我们分析了在DEN给药后肝脏中促炎细胞因子IL-6和TNF-α以及生长因子HGF的产生。有趣的是，DEN腹腔注射后，对照组和GαS^hep+/+小鼠的肝脏IL-6、TNF-α和HGF的产生没有显著差异(图S2G)。此外，从GαS^hep+/+和对照小鼠中分离的HcPCs的自分泌IL-6水平也显示出较小的差异(图S2H)。因此，GαS促进肝癌的发生不太可能是由于肝脏中IL-6的产生，这表明对IL-6的应答可能是由HcPCs中增加的GαS调节的。

3. HcPCs中GαS的增加促进IL-6的效应并驱动肝癌的发生

由于HcPCs具有自分泌IL-6并转化为肝癌细胞的能力，我们随后检测了HcPCs对IL-6的反应是否发生了改变。HcPCs中IL-6效应因子STAT3的磷酸化和激活显著增加(图2C)，而与对照组小鼠相比，GαS^hep+/+小鼠的HcPCs中IL-6 -STAT3信号通路增强，而GαS^{hep -/-} HcPCs对IL-6的应答减弱(图2D, E)。因此，HcPCs对IL-6的应答增强是由增加的GαS介导的。此外，为了证实在HcPCs中GαS的增加促进肝癌的发生，我们分离了CD44⁺的HcPCs，将其移植到野生型小鼠中，并使用CCl4注射5个月诱导肝炎症和HCC的发生。与对照组小鼠相比，GαS^hep+/+小鼠的HcPCs产生更多更大的HCC结节(图2F;图S2I)，而GαS^{hep -/-}HcPCs诱导肝癌发生的能力降低(图2G;图S2I)。总之，我们的结论是，GαS的增加介导了HcPCs中IL-6效应的增强，从而促进了癌前HcPCs转化为肝癌细胞。

图2 GαS促进肝癌的发生依赖于IL-6(A)对雄性GαS^F/F(OVER)、GαS^hep+/+、Il6 ^-/-和GαS^hep+/+Il6^/小鼠进行DEN诱导的HCC的肿瘤发生率(卡方检验)、数目和最大直径(非配对t检验)分析(n = 12)。(B)对雄性GαS^F/F(OVER)Il6ra^F/F、GαS^hep+/+、Il6ra^hep-/-和GαS^hep+/+Il6ra^hep-/-小鼠进行DEN诱导的HCC的肿瘤发生率(卡方检验)、数目和最大直径(非配对t检验)分析(n = 12)。(C)未聚集的肝细胞和分离的HcPCs在指定的时间内受到IL-6刺激，并检测STAT3磷酸化。(D)从雄性GαS^F/F(OVER)和GαS^hep+/+小鼠分离的HcPCs用IL-6刺激一段时间，检测STAT3磷酸化水平。(E)从雄性GαS^F/F(KO)和GαS^{hep- /-}小鼠分离的HcPCs用IL-6刺激一段时间，检测STAT3磷酸化水平。(F)GαS^F/F(OVER)和GαS^hep+/+小鼠分离的HcPCs经脾内注射移植到雄性小鼠后检测肿瘤数量和最大直径 (n = 6，未配对t检验)。(G)GαS^{F /F(KO)}和GαS^{hep -/-}小鼠分离的HcPCs经脾内注射移植到雄性小鼠后检测肿瘤数量和最大直径 (n = 6，未配对t检验)。数据显示为均值±标准差，图像为三次独立实验的一个代表性图像。△p > 0.05,*p < 0.05, **p < 0.01

4. GαS不依赖腺苷酸环化酶（Adenylyl cyclase, AC）激活来增强肝脏IL-6-STAT3信号通路

接下来在肝脏和肝细胞中分析GαS对IL -6诱导的STAT3信号转导的影响。DEN诱导的STAT3磷酸化在GαS^hep+/+小鼠肝脏中显著增加，但在GαS^{hep -/-}肝脏中被抑制(图3A,B)。我们通过肝门静脉将IL-6注入肝脏，发现在GαS^hep+/+小鼠中，STAT3的激活被增强，而在GαS^{hep -/-}小鼠中被抑制(图3C)。在GαS^hep+/+小鼠的原代肝细胞中，IL -6诱导的STAT3激活也增加，而在GαS^{hep- /-}小鼠的原代肝细胞中被抑制(图3D)。同时，与对照组相比，在miR-143^{- /-}小鼠中，DEN或IL -6诱导的肝脏STAT3磷酸化水平显著升高(图S3A,B)。此外，在人HHL5和小鼠BNL CL.2肝细胞系中，IL-6诱导的STAT3激活被GαS过表达促进，但被其敲除抑制(图3E,F;图S3C)。因此，GαS增强了肝细胞中IL-6效应信号。

同时我们检测了IL -6诱导的下游基因血清淀粉样蛋白a1 (Saa1)的表达，DEN和IL-6诱导的Saa1表达在GαS^hep+/+小鼠中均增加，而在GαS^{hep -/-}小鼠中被抑制(图3G,H)。由此，我们得出结论，在肝细胞中GαS促进IL-6效应的STAT3信号转导。

GαS结合GTP激活AC，促进cAMP的产生，调节细胞生理和病理过程。GαS过度活化的突变在各种癌症中非常普遍，但只在1%的HCC患者中发生。为了确定GαS是否通过激活AC来增强IL-6-STAT3信号，我们使用了NF449，它抑制了GαS介导的对AC活性的刺激。我们发现NF449处理不影响IL-6诱导的HHL5和BNL CL.2肝细胞系的STAT3磷酸化(图S3D,E)。此外，我们构建了GαS过活化和失活突变体，并通过cAMP ELISA进行验证(图S3F)，这些突变体显示了与野生型GαS相似的IL-6诱导的STAT3激活水平(图S3F)。综上，这些数据表明GαS促进IL-6-STAT3信号转导并不依赖它的GTPase活性和AC刺激。

图3 GαS增强IL-6 STAT3效应信号，而不依赖GTPase活性(A)雄性GαS^F/F(OVER)和GαS^hep+/+， (B) GαS^F/F(KO)和GαS^{hep -/-}小鼠在指定时间内腹腔注射DEN。western blot检测肝组织中STAT3的磷酸化水平。(C) (A)和(B)雄性小鼠在指定时间内通过肝门静脉注射重组IL-6。western blot检测肝组织中STAT3的磷酸化水平。(D) (A)和(B)雄性小鼠的原代肝细胞在体外用重组IL-6处理指定的时间。 western blot检测STAT3的磷酸化水平。(E)用阴性对照或GαS特异性干扰小RNA、对照载体或GαS过表达质粒转染HHL5和(F) BNL CL.2肝细胞细胞系，然后用重组IL-6处理指定的时间。western blot检测STAT3的磷酸化水平。(G)雄性GαS^{F /F(OVER)}和GαS^{hep +/+}， (H) GαS^{F /F(KO})和GαS^{hep -/-}小鼠在规定时间内经尾静脉注射DEN或重组IL-6。定量RT-PCR检测Saa1在肝脏中的表达(n = 3，未配对t检验)。数据显示为均值±标准差，图像为三次独立实验的一个代表性图像。*p < 0.05, **p < 0.01。缩写:h -,人类；m -小鼠；siRNA, 小干扰RNA

5. 细胞质易位的GαS与IL-6刺激下的STAT3相关联，从而阻碍SOCS3-STAT3的互作

为了研究GαS如何促进IL-6-STAT3信号转导，我们评估了GαS是否与STAT3直接相关。事实上，通过共免疫沉淀(co-IP)检测，我们发现GαS与STAT3互作，且被IL-6刺激增强(图4A)。它们的相关性也通过使用外源表达的标记结构的co-IP分析确定(图4B)。我们还在HHL5肝细胞中共表达V5-STAT3和Flag-GαS，发现GαS位于细胞膜内，并在IL-6刺激下移位到细胞质与STAT3共定位(图4C)。因此，胞质易位的GαS在IL-6刺激下与STAT3结合，可能促进IL-6-STAT3信号转导。

为了确定GαS-STAT3的关联如何促进STAT3的激活，我们筛选了参与IL-6-STAT3信号转导的激酶和调控因子。在IL-6刺激下，STAT3可以结合JAK1、JAK2、SHP1、SHP2和SOCS3，但不结合SOCS1、PIAS1和PIAS3(图S4A); 且在HHL5肝细胞中，SOCS3-STAT3的互作被GαS过表达抑制，但被其敲除增强(图4D)。此外，IL-6诱导的SOCS3-STAT3互作在GαS^hep+/+肝脏中减少，但在GαS^{hep -/-}肝脏中增加(图4E)。我们还发现GαS失活突变体与STAT3相关，阻碍SOCS3与STAT3的相作(图S4B)，而GαS - STAT3的关联不受GαS AC抑制的影响(图S4C)。为了确定GαS促进STAT3激活是否依赖于SOCS3，我们将GαS^hep+/+小鼠与Socs3^{hep -/-}小鼠杂交，生成GαS^hep+/+Socs3^{hep -/-}小鼠，发现GαS^hep+/+Socs3^{hep -/-}小鼠肝脏在IL-6刺激后表现出与Socs3^{hep -/-}小鼠相似的STAT3激活(图4F;图S4D)，表明GαS在SOCS3缺失的情况下不能促进STAT3的激活。此外，我们发现N端GαS和SOCS3分别与STAT3的Src同源2-转激活结构域结合，该结构域包含磷酸化和激活位点Y705(图4G,H)。结合已知的SOCS3介导的STAT3失活, 我们得出结论，IL-6诱导的和胞质易位的GαS与STAT3相关联而增强STAT3的激活，同时依赖于SOCS3-STAT3互作受阻。

图4 在IL-6刺激下胞质易位的GαS与STAT3关联抑制SOCS3-STAT3相互作用(A)IL-6处理指定时间后，在HHL5和BNL CL.2细胞中，通过co-IP检测GαS和STAT3之间的关系。(B)将标记的STAT3和GαS共转染到HEK293T细胞中后通过co-IP检测GαS和STAT3之间的关联。(C) v5标记的STAT3和flag标记的GαS共转染HHL5细胞。这些细胞在IL-6刺激下的共聚焦显微图像如图所示。比例尺为10 μm。(D)对照、GαS过表达质粒或GαS小干扰RNA转染HHL5细胞;利用co-IP分析STAT3与GαS或SOCS3的相关性。(E)雄性GαS^F/F(OVER)、GαS^hep+/+、GαS^F/F(KO)、GαS^{hep -/-}小鼠经肝门静脉注射重组IL-6;用co-IP分析肝组织裂解物中STAT3与GαS或SOCS3的相关性。(F)雄性GαS^hep+/+、Socs3^{hep -/-}和GαS^hep+/+Socs3^{hep -/-}小鼠在指定时间内通过肝门静脉注射重组IL-6, western blot检测肝组织中STAT3的磷酸化情况。(G,H)构建标记STAT3、Gα s、SOCS3及其缺失，共转染HEK293T细胞，细胞裂解液用Flag抗体沉淀及V5抗体进行免疫印迹实验。数据显示为来自三次独立实验的一个代表的图像。缩写:Ctrl,控制;DBD, DNA结合结构域;h -,人类;IB,免疫印迹;IP,免疫沉淀反应;m -小鼠;p -磷酸化;SH2-TA, Src同源2-反激活;WT,野生型

6. IL-6诱导的GαS K28的乙酰化导致其细胞质易位并与STAT3相关联

然后，我们研究了IL-6诱导GαS胞质易位及其与STAT3关联的潜在机制。由于蛋白的翻译后修饰(PTMs)已被确定在其结构、活性、定位、相互作用和功能中发挥关键作用，因此在IL-6给药后，我们使用质谱分析了HHL5细胞中GαS的PTMs，包括磷酸化、甲基化和乙酰化。未处理的细胞中发现了K211位点的甲基化，而IL-6刺激的细胞中发现了K28位点的乙酰化; K53和K181位点均有甲基化，表明GαS的N端结构域有4个新的修饰赖氨酸残基位点(图S5A)。我们构建了这些位点的突变体;只有模拟进化保守的K28去乙酰化的K28A突变体显著降低了GαS-STAT3的关联，而模拟乙酰化的GαS K28Q突变体增强了其与STAT3的关联，其他突变体的影响较小(图5A;图S5B)，这表明GαS在K28位点的乙酰化对于GαS-STAT3的关联非常重要。然后我们构建了针对K28-乙酰化的GαS的兔多克隆抗体(图S5C)，并确定了IL-6在小鼠肝组织和GαS抗体沉淀的全细胞裂解液中都诱导了GαS在K28位点的乙酰化(图5B,C)。因此，IL -6诱导的GαS在K28位点的乙酰化介导了其与STAT3的关联，进而增强了STAT3的活化。

由于GαS被确定为在IL-6刺激后从细胞膜转到细胞质并与STAT3相关联，我们随后检测IL-6诱导的GαS K28乙酰化是否也介导了其细胞质转位。共聚焦和western blot分析均显示IL-6在HHL5肝细胞中诱导了flag标记的野生型GαS的细胞质易位，在IL-6刺激后K28A去乙酰化突变体仍然定位在细胞膜上，K28Q乙酰化突变体定位在未处理肝细胞的细胞质上(图5D;图S5D)。此外，我们分析了GαS在非聚集的肝细胞和肝癌前体细胞HcPCs中的亚细胞定位，发现GαS也定位在HcPCs的细胞质中(图5E)。因此，IL-6诱导的GαS在K28位点的乙酰化介导其胞质易位，进而与STAT3相关，并增强HcPCs中STAT3的活化。

为了证明乙酰化的GαS在体内促进IL-6-STAT3激活中的作用，我们构建了模拟去乙酰化GαS的K28A突变鼠和模拟乙酰化GαS的K28Q突变鼠(图S5E)。在体内，GαS K28A小鼠肝脏STAT3磷酸化被抑制，而IL-6刺激后GαS K28Q小鼠肝脏STAT3磷酸化增强(图S5F)。同时，GαS K28A突变体定位在细胞膜上，而K28Q突变体分布在小鼠肝组织的细胞质中(图5F)。同样，肝脏GαS-STAT3关联在K28A小鼠中被抑制，而在K28Q小鼠中增加，同时在K28A小鼠中SOCS3-STAT3关联增加，在K28Q小鼠中降低(图S5G)。此外，DEN诱导的肝癌发生在GαS K28Q小鼠中增加，而在GαS K28A小鼠中减少(图5G)。我们的结论是，IL-6诱导GαS在K28位点的乙酰化，进而转位到细胞质，并与STAT3结合，促进IL-6-STAT3信号转导和肝癌的发生。

7. 与GαS的K28蛋白乙酰化相关的酰基蛋白硫酯酶1可消除C3位点的S-棕榈酰化，并启动GαS细胞质易位

接下来，我们分析了K28乙酰化介导GαS细胞质易位的潜在机制。已有研究报道GαS N端半胱氨酸3的S-棕榈酰化介导了其在质膜内的定位。我们发现，以模拟S-棕榈酰化的C3Y为阳性对照，模拟去S-棕榈酰化的C3S为阴性对照，GαS在C3处的 S-棕榈酰化被GαS K28Q乙酰化抑制，而被K28A去乙酰化增强 (图5H)。因此，IL -6诱导的GαS K28位点乙酰化可抑制C3位点S-棕榈酰化，从而促进GαS细胞质转位。此外，由于GαS的S-棕榈酰化是由含有棕榈酰转移酶的Asp-His-His-Cys (DHHC)基序所写，但被酰基蛋白硫酯酶1 (APT1)所消除，我们发现IL-6诱导了GαS和APT1之间的互作，这可被模拟去乙酰化的K28A抑制而被模拟乙酰化的K28Q增强 (图5I)。由此得出结论，IL -6诱导的GαS K28位点乙酰化促进APT1介导的C3 S-棕榈酰化的消除，从而启动GαS细胞质易位。

图5 IL -6诱导的GαS K28位点乙酰化介导其细胞质易位并与STAT3相关(A)将标记v5的STAT3和标记flag的GαS突变体转染至HHL5肝细胞系，并通过co-IP分析检测它们之间的关联。(B)通过肝门静脉注射IL-6的雄性小鼠肝组织裂解液中检测k28 -乙酰化的GαS，用GαS总抗体免疫沉淀。(C)在IL-6刺激后，使用来自HHL5细胞的总GαS抗体的沉淀中的特异性抗体检测k28-乙酰化的GαS。 (D)在转染了flag标记的GαS突变体的HHL5细胞中使用共聚焦显微镜检测IL -6诱导的GαS细胞质易位。比例尺为10 μm。(E)用共聚焦显微镜观察GαS在非聚集的肝细胞和HcPCs中的亚细胞分布。比例尺:20 μm。(F)检测GαS在雄性GαS K28A或K28Q突变小鼠肝组织中的亚细胞分布。比例尺:20 μm。(G)分析雄性野生型、Gα s K28A或K28Q突变型小鼠中DEN诱导的HCC的肿瘤发生率(卡方检验)、数目和最大直径(未配对t检验)(n = 12)。(H)通过酰基生物素交换实验检测IL-6刺激下HHL5细胞中表达flag标记GαS突变体的S -棕榈酰化水平。(I)将v5标记的APT1和flag标记的GαS突变体共转染到HHL5细胞中，并通过co-IP分析检测它们之间的相关性。数据显示为均值±标准差，图像为三次独立实验的一个代表性图像。*p < 0.05, **p < 0.01。缩写:h -,人类;HRP,辣根过氧化物酶;IB,免疫印迹;IP,免疫沉淀反应;m -小鼠;WT,野生型

8.KAT7介导il-6诱导的GαS K28位点的乙酰化

然后我们研究IL -6诱导GαS乙酰化的机制。我们使用质谱检测IL -6处理的HHL5肝细胞中与Flag标记的GαS共沉淀的蛋白，在可能的GαS相关蛋白中，KAT7因其乙酰转移酶活性而被选为候选(图S6A)。IL-6诱导的GαS- KAT7相关性在体内外均通过co-IP得到证实(图6A)。我们构建了KAT7缺失体，KAT7的MYST型组蛋白乙酰转移酶结构域与GαS的N端结构域相关联，其中K28位于该结构域(图S6B)。因此，KAT7与IL-6刺激后的GαS相关，可能介导IL-6诱导的GαS乙酰化。

随后，我们构建了肝细胞特异性KAT7敲除小鼠(Kat7^{hep -/-})(图S6C,D)，发现IL-6诱导的GαS K28位点乙酰化在Kat7^{hep -/-}肝脏中几乎消失(图6B)。IL- 6诱导的GαS- STAT3关联和STAT3磷酸化在Kat7^{hep -/-}肝脏中也被抑制(图6C,D)。此外，IL-6诱导的肝GαS细胞质易位被KAT7缺失所消除(图6E)。利用DEN诱导的HCC模型，我们发现在Kat7^{hep -/-}小鼠肝脏中肝癌发生被显著抑制，这与GαS^{hep -/-}小鼠中发生的情况相似(图6F)。我们同时构建了肝细胞特异性KAT7和GαS双敲除小鼠(Kat7^{hep -/-}GαS^{hep -/-})，结果发现在Kat7^{hep -/-} GαS^{hep -/-}小鼠和GαS^{hep -/-}小鼠中，DEN诱导的肝癌发生和IL -6诱导的STAT3磷酸化都很相似(图6G,H)，这就提示肝脏KAT7缺乏不能进一步抑制GαS缺乏下的肝癌发生，而抑制Kat7^{hep -/-}肝脏的肝癌发生依赖于GαS。总之，这些数据表明IL-6诱导的GαS在K28位点的乙酰化是由KAT7介导的，然后以前馈的方式促进GαS-STAT3关联，IL-6-STAT3信号转导，以及相应的肝癌发生。

图6 IL -6诱导的GαS K28位点乙酰化是由KAT7介导的(A)在体外HHL5和BNL CL.2细胞以及小鼠体内肝组织中，通过co-IP检测IL-6诱导的KAT7和GαS之间的关联。(B-D)雄性Kat7^F/F和Kat7^{hep -/-}小鼠经肝门静脉注射IL-6;检测GαS K28位点乙酰化(B)， STAT3磷酸化(C)，以及GαS与STAT3的关联(D)。(E)雄性Kat7^F/F和Kat7^{hep -/-}小鼠经肝门静脉注射IL-6后肝组织染色的共聚焦显微镜观察。比例尺:20 μm。(F)分析雄性Kat7^F/F和Kat7^{hep- /-}小鼠中DEN诱导的 HCC的肿瘤发生率(卡方检验)、数目和最大直径(未配对t检验)(n = 12)。(G)对雄性Kat7^F/F GαS^{F /F(KO)}、GαS^{hep -/-}和Kat7^{hep -/-} GαS^{hep -/-}小鼠进行肿瘤发生率(卡方检验)、数目和最大直径(非配对t检验)分析(n = 12)。(H) IL-6刺激下，在雄性GαS^{hep -/-}和Kat7^{hep -/-} GαS^{hep- /-}小鼠肝组织中评估IL-6诱导的STAT3磷酸化。数据显示为均值±标准差，图像为三次独立实验的一个代表性图像。△p > 0.05, *p < 0.05。缩写:h -,人类;IB,免疫印迹;IP,免疫沉淀反应;m -小鼠;p -,磷酸化

9. GαS的表达和乙酰化与人肝癌的发生和预后相关

为了分析GαS与人肝癌发生的相关性，我们检测了代表肝癌前病变的人肝异常增生结节中GαS蛋白的表达。与人类正常肝组织相比，人肝发育不良结节中GαS蛋白水平及其在K28位点的乙酰化均增加，伴有STAT3磷酸化增强(图7A C;图S7A)，这与小鼠肝癌祖细胞的数据一致。此外，与正常肝脏相比，异常增生结节中KAT7的表达中度增加(图7A,C)。而且，在人肝异常增生结节中，GαS的表达及其在K28位点的乙酰化均与STAT3磷酸化显著正相关(图7D,E)。因此，GαS在肝癌前异常增生结节中的增加可能介导STAT3的激活和人肝癌的发生。

我们还检测了GαS在人肝癌组织中的表达。与队列1(n=131)和队列2(n=129)患者的配对非肿瘤肝组织相比，人类HCC组织中的GαS蛋白水平升高(图S7B)，

在这些队列的HCC组织中，GαS蛋白水平与STAT3磷酸化呈正相关(图S7C)。

此外，GαS蛋白水平与肿瘤淋巴结转移进展期和高组织学分级均呈正相关(图S7D,E)。而且，HCC组织中GαS蛋白水平相对较高的患者，总生存期和无病生存期较GαS蛋白水平低的患者均缩短(图S7F)，这是在队列1和2中使用中位水平作为截止值确定的。Cox比例风险回归分析还发现，较高的GαS蛋白水平是HCC患者预后较差的独立预测因素(表S1和表S2)。因此，肝细胞癌组织中GαS的升高可能对判断肝细胞癌的进展和预后具有重要意义。

图7 GαS表达增加和乙酰化与人肝癌的发生有关(A)在人类正常肝组织和异常增生的结节组织中检测GαS, KAT7和STAT3磷酸化水平。(B)在人体正常肝组织和发育异常的结节组织中使用GαS沉淀抗体检测GαS K28乙酰化。(C) 人类正常肝组织和发育不良的结节组织中GαS、KAT7、STAT3磷酸化和GαS乙酰化的定量水平(n=12，非配对t检验)。 (D)采用Pearson相关系数法分析人异常增生结节组织中GαS与STAT3磷酸化的相关性(n = 12)。(E)通过Pearson相关系数分析法分析人异常增生结节组织中K28位点乙酰化的GαS与STAT3磷酸化的相关性(n = 12)。(F) kat7乙酰化和胞质易位的GαS前馈促进肝癌前体细胞对IL-6的反应并驱动肝癌发生的工作模型。数据以均值±标准差、点图或图片直接表示。缩写:DN，异常增生结节;IB,免疫印迹;IP,免疫沉淀反应;N,正常;p ,磷酸化

讨论

许多恶性肿瘤都经历了从具有生长和生存优势的罕见细胞群到形成癌前病变的过程。这些类型的癌症祖细胞首先在急性髓系白血病中被发现，随后在多种实体肿瘤中被发现，促进了癌症的起始和维持。例如，含有GPCR的富亮氨酸重复序列6标志着一种罕见的乳腺祖细胞群，可起源于腔内乳腺肿瘤。对于HCC，从临床标本中筛选的EpCAM⁺的 HCC亚型表现出干细胞样的自我更新和分化能力，可通过激活Wnt/β-catenin通路在免疫缺陷小鼠中激发高侵袭性HCC。然而，进一步的研究表明，干细胞样的特征对于肿瘤前细胞并不是必需的，并且从小鼠肝癌模型中分离出的HcPCs导致HCC仅结合肝的慢性损伤和依赖于旁分泌和自分泌IL-6信号的炎症。有趣的是，聚集的肝细胞的转录组似乎更接近于正常肝细胞而不是肝癌细胞，这是因为聚集物中存在70%的CD44^-肝细胞。其余30%的CD44⁺聚集物，被鉴定为HcPCs，表现出与HCC类似的标志物，如EpCAM、AFP和Ly6D，这可能是其致瘤性的原因。机制上，CD44通过诱导Mdm2原癌基因磷酸化和核转位抑制p53基因组监视反应，促进HcPC增殖和癌症起始。在这里，我们确定了GαS蛋白水平在HcPCs中升高，但在非聚集性HCC中没有升高，这表明在从肝癌前体细胞HcPCs到完全建立HCC的癌变阶段，GαS水平升高。随着自分泌和旁分泌IL-6的增强在HcPCs向HCC发展中发挥关键作用，以及目前的数据显示增加GαS可增强IL-6效应信号，我们可以得出结论， IL-6生成的增强和IL-6反应的增加在肝癌发生中都很重要，特别是在HcPCs进展为HCC的阶段。

IL-6是肝脏中最具特征和最关键的原癌细胞因子之一，它的效应信号传导促进了肿瘤前体细胞的早期癌变和已建立的HCC的晚期进展。我们的结果表明，GαS过表达小鼠肝细胞肝癌的体积明显大于正常对照组。因此，在IL -6介导的HCC细胞的进展中，GαS的增加可能对其发展也很重要，这是最近提出的。在肝癌发生过程中，肝癌前体细胞获得自分泌IL-6的能力成为HcPCs，然后IL-6促进癌前HcPCs向HCC转化。 尽管对IL-6的应答受到多种细胞内机制的严格控制，以防止其在肝细胞中过度活化，但在HcPCs中IL-6效应信号明显增强，从而推动肝癌前体细胞的恶性进展。在这一过程中，GαS诱导和IL-6诱导的乙酰化和细胞质转位被认为是HcPCs中IL-6 STAT3信号通路过度激活的原因。然而，虽然miR-143的降低可以介导HcPCs中GαS蛋白水平的升高，但在正常肝细胞向肝癌前HcPCs转变过程中，这种机制何时以及如何发生仍有待研究。

GPCR家族成员可被各种激动剂配体激活，包括光子、脂质和小蛋白;它们的激活引起GTP结合的G蛋白α亚基(Gα)的释放。GαS是Gα家族的成员之一，通常刺激AC增加细胞内cAMP，进而激活下游蛋白激酶A，促进细胞生长和存活。在肿瘤中GPCR活化及下游cAMP常升高，促进肿瘤进展。GαS的激活突变和cAMP的增加也具有致癌作用，可触发癌细胞增殖。然而，这些激活突变在HCC组织中很少检测到(<1%)，提示GαS-cAMP信号通路与HCC的癌变和进展并不密切相关。在这里，我们确定GαS促进HCC的癌变独立于其GTPase活性和cAMP的增加，但依赖于其细胞质易位和与STAT3的直接关联，它们促进HcPCs中的IL-6效应信号传导。GαS这种非典型的、不依赖于cAMP的促进肝癌发生的功能可能表明G蛋白组分在调节细胞内信号通路，特别是炎症信号通路方面具有更直接的方式。此外，G蛋白的其他成分，包括Gβ和Gγ，在炎症诱导肝癌发生中的作用也是未知的。GαS在肿瘤发生中的作用可能为其他G蛋白成分在癌症发展中的作用提出有趣的未来研究方向。

蛋白质的PTMs在蛋白质的结构形成、亚细胞定位和蛋白质相互作用中起着重要作用，从而调节蛋白质的功能。GαS的PTMs，特别是棕榈酰化，已被认为是其亚细胞定位和功能的重要因素。GαS的N端甘氨酸2的S-棕榈酰化可增加其AC亲和力，而N端C3的S -棕榈酰化可促进其定位在质膜内。GαS的棕榈酰化是由含有棕榈酰转移酶的DHHC基序介导的，但被APT1消除，据报道这是GαS在细胞膜内定位所必需的。本研究发现， GαS在K28位点的KAT7-乙酰化促进了其与APT1的关联以及C3位点S-棕榈酰化的消除，从而导致GαS的细胞质易位及其与STAT3的关联。因此，GαS在K28位点的乙酰化可能是其与其他蛋白相互作用的重要机制，其结构基础有待进一步研究，这可能揭示PTMs调控GαS亚细胞定位和蛋白相互作用的完整机制。

在与我们的研究结果一致的最简单的模型中，我们提出SOCS3反馈抑制IL-6诱导的下游STAT3磷酸化，以避免肝细胞中IL-6效应信号的过度激活。然而，在肝癌前体细胞HcPCs中，GαS蛋白水平的升高促进IL-6效应信号传导，并驱动癌前体细胞HcPCs转为HCC。在机制上，IL-6诱导和KAT7在K28位点的乙酰化使得GαS易位到细胞质，与激活的STAT3相关，并阻碍SOCS3介导的失活，这以前馈方式促进IL-6-STAT3信号转导并驱动肝癌发生(图7F)。总之，我们的数据表明，肝癌前体细胞向HCC的恶性进展需要KAT7-乙酰化和细胞质易位的GαS的增加。

原文链接：  

https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/35344606/

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