科研 （IF:47.990）|Nat Methods：蛋白质组成和组织结构的空间映射：基于多重抗体成像的入门手册
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编译：微科盟-苏天行，编辑：微科盟Emma、江舜尧。
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导读组织和器官由不同的细胞类型组成，它们必须协同工作才能发挥生理功能。创建这些细胞的高维生物标志物目录，主要是基于单细胞测序的方法，这就缺乏了理解关键细胞通信和相关结构组织所需的空间背景。为了以足够的深度探测原位生物学，最近开发了几种多重蛋白质成像方法。尽管这些技术在免疫标记和检测标签的策略和模式上有所不同，但它们通常利用针对蛋白质生物标志物的抗体来提供复杂组织的详细空间和功能图谱。随着这些有前途的基于抗体的复用方法越来越被广泛采用，新的框架和考虑对于培训未来的用户、生成分子工具、验证抗体组和协调数据集至关重要。从这个角度来看，我们提供了必要的资源、获取稳健和重复性的成像数据的关键考虑，以及领域专家和技术开发人员的专业知识。
论文ID
原名：Spatial mapping of protein composition and tissue organization:a primer for multiplexed antibody-based imaging译名：蛋白质组成和组织结构的空间映射：基于多重抗体成像的引物期刊：Nature MethodsIF：47.990发表时间：2022.03通讯作者：Sinem K. Saka通讯作者单位：哈佛大学威斯生物启发工程研究所&欧洲分子生物学实验室（EMBL）
主要内容
1 前言
哺乳动物组织包括具有独特功能属性和激活状态的多种细胞。许多现有的方法——免疫组织化学（IHC）、免疫荧光（IF）、转录组学、质谱和细胞术，通过以单细胞分辨率研究组织和器官系统来捕捉这种异质性和复杂性。所有这些方法都代表了空间信息和覆盖深度之间的权衡。基于流式或液滴的单细胞方法，如多参数流式和质谱仪、单细胞RNA测序（scRNA-seq）和通过测序对转录组和表位进行细胞索引（CITE-seq），可以以令人难以置信的粒度定义独特的细胞亚群。这些技术极大地扩展了我们对细胞类型和状态的理解，并为样本或患者的多参数分层提供了新的方法，同时确定了临床研究的潜在目标。然而，它们通常需要组织分离，不为正常组织中存在的细胞间相互作用提供空间背景，且空间背景可能会在疾病中发生改变。此外，这些方法无法检索所有细胞类型，原因是多种因素的混杂，包括但不限于：组织内单个细胞类型的解离程序的差异、分选过程中的细胞损失以及由于成本或测序深度而导致的低采样。最近的基于成像或测序的方法可以以单细胞分辨率探测空间转录组，但原位蛋白质检测主要依赖于抗体。因此，抗体一直是几种新的复用方法的核心，而这些方法允许在蛋白质水平上检测组织的空间细胞组织和组成。
这些多重成像技术能够对人类组织中感兴趣的细胞类型（淋巴细胞、基质细胞和结构标记物等）进行详细的调查和表征，超越常规荧光显微镜的光谱限制（通常<5个目标）。随着通过复用检测到的蛋白质生物标志物的数量增加（通常>10–50个参数）（图1a），分析变得越来越复杂。因此，需要更多的努力来进行多重面板设计、抗体验证和仔细的数据采集，以避免伪影并保持可重复性。未来的分析将需要强大的工作流程，以生成高质量的图像，以及最佳挖掘这些数据所需的计算工具。在此，我们总结了几种基于多重抗体的成像方法，并概述了样品和定制试剂制备、严格抗体验证和多重面板构建的策略。然后，我们将讨论围绕图像数据处理、分析和存储的独特挑战。最后，我们分享了该领域未来的观点，强调了这些方法的实用性，并提供了其广泛采用的实用指南。
2 基于复用抗体的成像方法
基于复用抗体的成像方法可以根据抗体标记的模式（例如金属标记、荧光团、DNA寡核苷酸条形码或酶）和检测模式（例如质谱、光谱、荧光或色原沉积）进行分类，每种方法都有明显的优缺点（补充表1和图1b）。已有文献讨论了这些方法的详细描述，因此我们将重点放在高度复用成像实验的实用方面。在这些基于抗体的成像模式中，鉴于试剂和成像系统的广泛可用性，基于荧光的复用成像是最成熟的（图1b）。一般来说，由于所选荧光团的光谱重叠和标记的商业抗体的可用性，荧光实验仅限于在单个成像周期内可视化抗原。高光谱方法使数据收集超出了这一限制，通过利用具有不同激发和发射光谱的荧光团、先进的仪器和能够补偿光谱重叠的方法，实现了多达21个通道的单程复用成像（补充表1）。
甚至更高维度的数据集可以通过迭代的多步骤过程（或循环）获得，包括（图1b）：（1）用荧光或寡核苷酸条形码抗体进行免疫标记；（2）直接图像采集（荧光抗体染色材料），或与标记抗体子集的荧光互补寡核苷酸反应，然后进行图像采集；（3）荧光团灭活或去除抗体或杂交寡核苷酸探针。这些过程通过在每个周期反应后，去除荧光信号来避免光谱重叠。迭代染色、成像和漂白/抗体去除方法，通过使用市售的荧光一抗或二抗，可以在同一组织切片中检测到>60个目标。例如基于组织的循环免疫荧光（t-CyCIF）、迭代间接免疫荧光成像（4i）、迭代漂白扩展复用（IBEX）、多表位配体制图（MELC）和复用免疫荧光（MxIF，Cell DIV）。这些方法的关键考虑是较长的实验时间，原因是抗体孵育步骤长、表位丢失的可能性、组织降解和连续循环中荧光团失活不完全。出于这些原因，重要的是包括此处概述和前面描述的合适控制。
依赖于抗体DNA条形码的替代方法，如DNA交换成像（DEI）、通过交换反应进行信号放大的免疫染色（immuno-SABER）和通过索引进行共检测（CODEX），可以通过荧光寡核苷酸的快速结合/解离，实现一步免疫染色和快速时序条形码读取。尽管这些方法可以在多种组织中检测大量的靶分子，但它们在样本中的应用受到了限制，例如苛刻的固定减少了表位的保留，或组织具有高自体荧光。扩增方法如immuno-SABER、免疫信号杂交链式反应和酶（例如辣根过氧化物酶）或酪胺信号放大技术（TSA）方法可用于提高信噪比，同时增加低丰度表位的检测。直到最近，TSA方法（如Opal IHC）仅限于同时检测6–8个标记物，因为尽管进行了多轮抗体去除和扩增，酪胺连接的荧光团仍然与组织结合。尽管如此，最近的文献表明，使用硼氢化锂可以扩大Opal IHC的荧光团范围，以消除来自几种Opal染料的信号，为在高度固定的组织中捕获高度复用的图像提供了一种方法。
基于荧光方法的另一种选择是基于质谱（MS）的方法，该方法结合了可电离的金属质量标签（图1b）。这些技术能够使用金属结合一抗的单管反应混合液，在组织切片中显示>40个生物标志物，并且不需要抗体染色/去除周期。两种最常见的技术是多路离子束成像（MIBI）和成像质谱流式（IMC），它们的区别在于分别使用离子束或激光进行标签电离。这些基于质谱的技术的主要好处是能够同时检测和解析数十种金属同位素标记的抗体，可以恰当地称为“一体化”。金属离子条形码通过避开自身荧光并结合高仪器质量分辨率，从而具有低背景信号。与其他复用方法不同，基于质谱技术的样品必须是真空稳定的，并且抗体标签不能被扩增。然而，MS系统的检测极限在阿托摩尔量级。不含牛血清白蛋白（BSA）的抗体制剂的可用性，与其他成像工作流程相同，需要定制试剂（例如螯合或荧光团偶联）。与扩展金属标记抗体组合相关的，另一个潜在障碍是需要获得足够量的同位素纯化镧系金属。虽然图像采集在一个周期内进行，但考虑到大视场（约200像素/秒或1 mm2/2小时）时，图像采集可能会很慢。最后，到目前为止，这些仪器的操作稳定性不如传统荧光显微镜，需要更专业的人员和环境才能有效使用。
同样采用一体化数据收集的其他光谱方法包括：使用诸如受激拉曼散射（SRS）或表面增强拉曼散射（SERS）等技术的多重振动成像。这些方法利用不同波长的荧光团和专用修饰剂的增强振动特征，代替质量条形码，以复用20多个目标。用于光谱复用成像的样品制备与用于荧光显微镜的样品类似，并且可以在没有真空系统的情况下在各种组织制备物上进行。
除了在二维（2D）中研究组织外，样品制备和成像的最新进展使我们能够探索整个组织（三维，3D），以加深对整个器官结构的理解，同时允许对薄（5–10μm）组织切片中经常采样不足的罕见细胞进行详细描述。例如，化学清洗方法可用于将完整的组织和器官转化为坚固、透明的样本，以便后续的抗体染色和成像。重要的是，清除方法必须保持蛋白质和核酸的空间分布，同时保持对荧光探针的渗透性。可供选用的几种组织透明化方法包括：清晰脂质交换丙烯酰胺杂交精细成像相容性组织水凝胶（CLARITY）、清晰增强3D（Ce3D）、化学物质相互作用时间和动力学的全系统控制（SWITCH）、蛋白质组放大分析（MAP）、通过分子内环氧化物连接在苛刻条件下稳定并防降解（SHIELD）、缠结连接增强的可拉伸组织水凝胶（ELAST）和蛋白质保留膨胀显微镜（pro-ExM）。据报道，在透明化后，组织可接受抗体染色，随后使用加热、洗涤剂、寡探针脱杂交或荧光还原去除探针。这允许更高复用3D成像的潜力。尽管电泳加速抗体转运和光片显微镜的使用使整个小鼠器官能够在一天内染色并在数小时内成像，但由于所分析的组织体积较大，染色和成像步骤明显长于常规组织学。总之，这些方法能够对完整组织进行快速和多重3D研究，提供系统规模的结构和分子信息。
3 初步实验考虑
当选择采用或实施基于多重抗体的工作流程时，我们建议遵循一个口号：“以目标为起点”。在选择组织空间分析的方法时，样品的数量、复用成像是否是概述工作的核心重点、可用预算和分析支持是关键的考虑因素（图2a）。如上所述，每种复用成像方法都有明显的优势和劣势。因此，关于最终的数据要求、可用的样本和格式以及现有的基础设施等问题，必须指导复用成像方法的选择（图2b和补充表1）。同样，创建复用成像组合的第一步，也是最基本的一步，是确定要解决的科学问题。由于所有的复用成像方式都有一个创建和验证复用抗体组合的过程，我们的大部分建议都集中在创建一个由10-60种抗体组成的验证组合上（图3）。
3.1 组织处理
这里描述的基于多重抗体的成像方法与通常的组织和样品制备兼容，包括新鲜冷冻组织（FF）、福尔马林固定或福尔马林固定石蜡包埋组织（FFPE，图3）。在决定样品制备方法时，应考虑组织结构的保存、长期储存条件、表位可及性以及复用组织成像的方便性。为此，FFPE工作流程比大多数FF方法更好地保存整体组织结构和细胞形态。此外，由于增强的保存和与室温储存的兼容性，大多数临床或存档组织都以FFPE块储存。然而，FFPE保存使许多靶表位无法接近，福尔马林固定增加了自体荧光，并且经常需要抗原修复。与单标记IF/IHC相比，适用于一个表位的抗原修复条件可能与另一个表位不兼容，需要针对不同分子的不同抗原修复方法，这使得复用组合开发越来越具有挑战性。相比之下，FF组织避免了抗原修复的需要，而是需要立即快速冷冻和超低温储存（<80°C），以获得最佳的组织保存。最后，使用1%多聚甲醛和洗涤剂的组织保存方法已被证明可以保存组织结构，通过溶解红细胞使组织自身荧光最小化，并能够用大量抗体进行免疫标记，而无需在各种人和小鼠组织中修复抗原。
3.2 成本
在设计高度复用的成像实验时，一个被忽视的考虑是总体成本和时间投资，包括试剂、抗体、训练、组合优化、图像采集和数据分析（图3）。最终，当合理化地描述增加的成本时，每个唯一数据点的成本和背景复用数据的影响是有用的指标。例如，一个单重实验可能需要几百美元，而一个50重的组合对于相同数量的组织样本可能需要数千美元。某些因素会促使组合的时间和成本大幅增加，包括：组合的复杂性（例如抗体数量、样本类型、样本制备步骤）、多个周期内目标表位的稳定性（如果适用）、抗体相容性和在统一免疫标记条件下的性能，以及迭代组合设计和调整以获得最佳结果。此外，鉴定和获得候选抗体可能需要几天到几周的时间，并且可能还需要用直接标签修饰一抗。特别是，对于应用于新组织类型的复杂组合，原位验证可能需要数周甚至数月的时间，其中每个抗体需要首先在单重实验中进行验证，然后评估整个组合的性能。并非所有抗体克隆都可能在所有复用技术中工作，并且每个复用技术都需要样本特异性抗体滴定。基于MS的平台甚至更昂贵，需要专门的成像仪器和昂贵的标记试剂。除了原材料之外，不同的分析和方法对培训的要求也有很大的不同，这会大大增加成本。由于这些方法的循环性质，基于荧光的方法比基于MS的方法在组合开发上投入了更多的时间。然而，随着复用方法的商业化和核心设施的采用，时间、培训和优化成本最终将降低。
3.3 目标选择
此外，考虑下游分析要求至关重要：图像配准（例如DAPI或Hoechst 33342等核标记）、细胞分割（例如稳健的核和膜染色）和无监督聚类（例如使用标记物组合的表型区分群体）。通过考虑这些要求，建议将公认的标记物排序并分类为“必要”或“期望”，从而大大加快整个组合的开发。这些信息，连同预算和大致时间线，将决定复用成像组合中要纳入的标记物数量。
可以通过专家知识、现有文献、正交数据集/在线资源来指导标记物选择（补充表2）。在建立分子的目标列表后，下一步是评估和购买合适的抗体。近年来，已经产生了多个抗体搜索引擎，提供了直观的用户界面，通过引用或基于人工智能的方法来管理抗体克隆（补充表3）。除了找出被高度引用的抗体克隆，这些平台允许研究人员查询许多相关的搜索领域，如组织和细胞类型、应用、公司和宿主物种，同时通常提供参考图像。值得注意的是，这些数据库没有提供与复用成像相关的性能细节，例如表位稳定性、空间位阻以及与其他抗体的兼容性。出于这些原因，我们提供了一份先前使用高内涵成像方法验证FF、福尔马林固定组织/FFPE制备的小鼠和人类组织的抗体克隆列表（补充数据集）。此外，最近的一份报告概述了用于多种人体组织高度复用成像的组织特异性组合。这些资源是创建自定义组合的起点，可以根据感兴趣的多路成像方法和问题进行定制。
对于对常规复用成像感兴趣的实验室，我们建议创建具有成熟抗体的基础组合，可以根据需要进行扩展。这种方法减少了抗体验证的时间和资金。此外，具有适当质量控制措施的重组单克隆或多克隆抗体提供了最小的批次间差异，使得它们更适合于高度复用化的组合开发。除此之外，优先选择严格质量控制的杂交瘤衍生单克隆抗体，最后是多克隆抗体。无论抗体类型如何，建议对每个供应商批次进行应用和样品特异性测试，以确保实验的重复性。
3.4 创建定制试剂
许多低重IHC和IF方法利用经二抗与一抗的检测（间接检测）来实现信号放大。虽然方便，但由于一抗宿主物种和同种型之间的显著重叠，这些间接标记方法通常不能用于获得高度复用的数据集。因此，通常需要用能够检测的官能团修饰一抗（图4和补充表1）。最终，试剂制备策略取决于成本、材料可用性、技术能力、规模和预期的实验设计。
在选择标记化学物质和交联剂之后，工作流程通常包括以下步骤：（1）活化修饰基团（例如减少巯基）和缓冲液交换；（2）与交联剂反应；（3）去除过量的交联剂；（4）抗体与修饰剂反应。由于反应通常包括过量的修饰剂，在寡核苷酸条形码修饰剂的情况下，可选用缓冲液置换、凝胶过滤或序列直接拉下（pull-down），从混合物中除去未反应的分子。可以通过离子交换或尺寸排阻色谱法进行进一步纯化，以去除聚集或降解的分子、残留的修饰物和未结合或过度结合的抗体。虽然纯化的试剂通常会提高质量和性能，但纯化可能会大大降低结合抗体的产量，从而使小规模制备变得不切实际或成本高昂。最终产物及其纯度可通过SDS–PAGE凝胶上的带移进行验证，其中可观察到抗体和修饰物（例如使用考马斯、荧光、Sybr染色或银染色）。虽然交联剂可能会干扰这些吸光度测量，因此需要进行相应的校正，但可以使用二喹啉甲酸测定法（BCA）或分光光度法（例如NanoDrop）来测定所得的抗体浓度。重要的是，应使用直接检测或二抗检测，通过与未结合抗体的功能比较，重新验证最终产物的正常靶结合特异性（例如通过流式细胞术）和感兴趣的测定。
多种偶联方法用于抗体标记，每种方法都有不同的优点和缺点以及几个可调变量，包括但不限于：交联剂化学、交联剂浓度、pH、修饰剂浓度、反应缓冲液和纯化策略。标记程度和偶联物纯度/均一性等因素可能因方法和可调变量而异。通常，偶联化学靶向抗体的赖氨酸、半胱氨酸或聚糖残基（图4），但也有其他定点方法靶向抗体氨基末端、明确的赖氨酸基或结晶片段（Fc）区域。此外，一些非共价方法依赖于二级亲和试剂（例如抗原结合片段（Fab）结构域、纳米体或proteinA/G）的预混合以用于复用。
3.5 偶联化学
通常优先使用赖氨酸直接偶联常规染料和寡核苷酸条形码，因为它们快速、成本有效、可控且可扩展。一个典型的IgG具有超过40个暴露于溶剂的赖氨酸，这些残基上的结合程度使得能够调节抗体与修饰剂的比率。虽然可优化，但标记不是特定位点的，可能导致与非赖氨酸氨基酸残基的异质化偶联和交叉反应。如果关键赖氨酸位于抗体活性位点，则修饰可降低表位结合活性。这些因素会使探针标准化和验证更加困难，而最近的出版物描述了特定位点的赖氨酸修饰，这可能会解决其中的一些问题。
或者，半胱氨酸直接偶联也是快速、成本可控、可扩展的，并且优选用于添加金属标签和寡核苷酸条形码。尽管基于半胱氨酸的偶联已被证明能产生更均匀和可重复的结果，但典型IgG上只有12个可用的半胱氨酸位点。除了较低的标记度外，半胱氨酸残基的接近可能导致染料相互偶联，这往往会由于猝灭而降低荧光。此外，在与马来酰亚胺荧光团/螯合剂或交联剂偶联之前，必须用二硫苏糖醇或三（2-羧乙基）膦轻度还原抗体，而这会影响抗体结构和亲和力。
通常，当其他方案失败时，或当结合寡核苷酸条形码时，聚糖直接偶联方法优选用于小规模的偶联。平均而言，IgG在重链上包含两个聚糖位点。因此，聚糖直接偶联具有位点特异性，需要较少优化抗体与修饰物的比例，更具重复性，并避免结合位点失活。不幸的是，该方案通常需时较长，需要酶促反应，成本更高且难以规模化。
标准商业抗体制剂可能与偶联化学制剂不直接兼容，因为它们通常含有叠氮化钠、牛血清白蛋白（BSA）、甘油/冷冻保护剂。为了促进结合，我们建议购买PBS等简单缓冲液中的抗体或进行亲和纯化。此外，储备应保持在PBS或硼酸盐缓冲盐水中。由于每次偶联都会导致抗体损失，建议从50–100μg纯化抗体开始，以产生可观数量的产物。尽管偶联程序和方法显著不同，但我们直观地总结了常见的方法（图4）。
3.6 偶联注意事项
最终，定制抗体试剂的生成和验证是开发基于复用抗体的成像组合的主要瓶颈。与单重抗体相比，复用实验相关的偶联抗体，在扩展实验的计划和验证中增加了成本和工作量。定制偶联还引入了额外的批次间变化，特别是在学术研究中进行的小规模制备。虽然商业化的定制偶联服务和现成的偶联试剂盒可以更容易地修饰抗体、定制组合，但与染料、金属和寡核苷酸条形码库偶联的市售一抗，因其便利性而得到广泛采用。此外，抗体性能经常受到其所结合的金属标签、荧光团或寡核苷酸条形码的影响（补充图1）。因此，针对低丰度表位的抗体应和不与天然自体荧光重叠的明亮荧光团结合。类似地，先前已针对组织类型验证的金属基团和寡核苷酸序列组合是优选的。定制偶联后，应通过与未偶联抗体的比较来确认最终抗体偶联物的功能性，并用对目标测定而重新评估（图4）。修饰的抗体还可能需要改变组织封闭和抗体孵育条件以获得最佳性能。
4 复用抗体组合的设计与开发
4.1 抗体验证
每个工作流程都必须验证抗体，因为抗体性能取决于组织类型、保存方法、抗原提取条件、最终抗体浓度、培养缓冲液和检测方法（图3）。尽管Uhlen等人已经描述了抗体验证的最佳实践，并且之前已经广泛涵盖了基于复用抗体的组织成像，但我们建议考虑：（1）抗体靶的组织和亚细胞位置，（2）阳性和阴性组织对照，（3）天然组织自体荧光和其他类型的背景，（4）标记物相容性（例如，抗体之间没有交叉反应性或空间位阻），（5）通过单重IF或IHC实验确认抗体特异性，以及（6）信噪比，特别是对于不能扩增的实验（补充图1）。除了这里讨论的抗体特异性搜索引擎（补充表3）之外，定期更新的数据库（补充表2）可以帮助确定标记物的位置和相对丰度。利用这些信息，我们可以使用适当的组织来验证抗体，这些组织中靶向分子的表达得到了充分的证明。此外，敲除或敲低细胞系或具有不同靶点空间表达模式的组织可用于进一步验证抗体的特异性。最后，病理学家可以为抗体染色的特异性提供宝贵的意见，特别是在罕见的临床样本或非典型标志物的情况下，人工染色可能更难辨别。虽然我们在这里提供了复用的抗体验证概述，但早期的资源提供了对抗体验证过程的更深入和集中的讨论。为了提高结果的重复性和可信度，我们建议在已发表的工作中提供抗体验证的元数据（补充表4）。
影响抗体性能的另一个考虑是天然组织自发荧光，其可以随组织类型、疾病状态、样品制备和固定方法而变化。自发荧光可以显着影响标记物的可视化，特别是如果这些标记物不与荧光团配对或具有较高信号产量的光谱通道。因此，即使抗体的靶特异性得到验证，与组织自发荧光相比，其有效使用将取决于每个组织中的预期信号（特别是如果标记不能被扩增的话）。虽然没有控制自发荧光的标准方案，但我们提供了常见内源荧光团的信号最小化方案作为该领域资源的策略（补充表5）。
4.2 全组合验证
这里讨论的许多复用成像方法采用同时或迭代孵育的大量抗体。因此，一旦建立了所需的标记物列表并且抗体特异性验证完成，就有必要验证整个组合，因为可能存在抗体之间的交叉反应性，或组合内需要调整报告分子或条形码的光谱重叠（图3）。当复用组合中的任何抗体需要抗原修复时，相同的抗原修复方法必须适用于组中的所有抗体。因此，将复用组合内抗体的特异性与其在单重实验中的表现进行比较是至关重要的。如果抗体的表现与该单重实验不同，则可能需要进一步调整（例如优化染色或偶联条件，或更换抗体克隆）。
最后，我们建议在动态范围内滴定抗体，以确定最佳的信噪比，同时限制光谱重叠。初始抗体验证和复用组合设计可以在以与实验组织相同的方式制备的对照组织中进行。对照组织的使用，保证珍贵样品可用于完全验证的抗体组合及最终的图像收集。细胞或组织微阵列（TMA）对于定量评估同一载玻片上的最佳抗体滴定特别有用。TMA，特别是多器官TMA，也被推荐用于在单个染色轮中验证跨多个组织的抗体特异性。最近，TMA被用于验证IMC抗体并使用AQUA预测与疾病结果相关的生物标志物（AQUA是基于分子的细胞区室划分，并以亚细胞分辨率自动测量信号强度的软件）。对于循环方法，有必要验证在每个染色/漂白循环或抗体去除步骤期间组织形态和靶表位的完整性。验证方法已在别处详述，包括：（1）比较单重（连续）和循环（迭代）成像实验中的抗体性能，（2）改变抗体添加顺序（第一周期与第四周期），以及（3）在多个周期内重新成像相同的目标。如果观察到抗体免疫原性丧失，我们建议将受影响的抗体更早地置于循环顺序内、用不同的抗体克隆取代、优化循环条件，从而提升抗体的信号强度。
5 重复性和数据分析
任何科学方法面临的最大挑战之一，是已发表结论的可重复性和严格性，特别是对于在没有严格控制的实验的情况下、易于产生可变结果的基于抗体的方法。由于基于复用抗体的实验的复杂性，我们鼓励在已发表的工作中包含详细的验证数据，或者将这些数据作为公开可用数据集的一部分保存。通过对这些过程进行强制和标准化，我们可以促进适当的数据发布和使用实践，这无疑将提高实验的严谨性和可重复性。共享有效抗体的数据共同节省了大量的时间和资源，但需要广泛、多管齐下的验证和稳定的抗体生产。我们相信商业产品在未来采用和高精度使用复用方法方面发挥着重要作用。获取特定应用的供应商验证和质量控制数据的详细信息（例如最佳浓度、测试过的抗原检索协议、缓冲液条件、稳定性/储存条件、RRID/克隆信息），生产具有已知序列/外显子的单克隆抗体，更广泛的抗体标签选择，以及灵活的配方（例如偶联兼容缓冲液、冻干产品）将大大支持这一领域。公开可用的数据存储库，例如HuBMAP数据门户，HTAN数据门户，人类蛋白质图谱（The Human Protein Atlas），癌症影像数据库（The Cancer Imaging Archive），可以作为分享和评估数据的早期领域加以利用。
另一个很大的可变性来源于原始成像数据的处理方式和程度。为了便于讨论，我们建议使用可以描述任何复用成像集的预定义数据状态（补充表6）。许多这些处理和细分分析可以使用商业软件、免费软件和实验室构建的软件包的组合来执行。一些最广泛使用的软件包包括：Zen（商业和免费软件，Zeiss），ImageJ（开源），ASHLAR（开源），cytokit（开源），CellProfiler（开源），CellPose（开源），NAPARI（开源），CODEX Processing and inForm/MAV（商业，Akoya Biosciences），HALO（商业，Indica Labs），QUPath（开源），DeepCell（开源），ilastik（开源），Visiopharm TissueAlign/TMA（商业，Visiopharm），histoCAT（开源），MCMICRO（开源），Squidpy（开源），CytoMAP（开源）等等。另外，现在还开发了无分割方法，用于使用基于像素的亚细胞特征分配以及不规则形状的肌上皮细胞的分类来定量分析成像数据。
由于使用平铺和z-堆叠，在多个成像周期的扫描大面积的感兴趣区域，导致复用组织成像实验产生相当大的结果文件。为了解决这个问题，需要具有大量内存、高处理速度、高效显卡、集成存储和多核处理器的工作站或计算机服务器来处理这些大型数据集。一般来说，处理流程是按数据状态级别工作的，主要是不同软件包的积累，并将原始数据转换为处理和分段数据。值得注意的是，细胞类型或功能单元注释通常需要结合领域专家（例如病理学家或组织生物学家）的意见，这限制了分配的速度，有时甚至是准确性，因为这样的任务不能容易实现自动化。
6 未来的方向和挑战
尽管需要努力进行更复杂的实验设计和彻底的验证，但复用成像实验是很重要的，而且往往是在复杂的生物系统中原位观察各种细胞类型和生理状态的唯一途径。例如，复用成像技术的最新进展允许在一个组织切片内染色超过60种抗原；比在最好的显微镜系统上进行的单次实验要高一个数量级。大多数哺乳动物系统包含数百种不同的细胞类型，这些细胞具有基本功能，并受其空间位置和相邻细胞的调节。重要的是，疾病的形成、发展和治疗反应可能受组织内独特的细胞关联所支配。所有这些因素都需要高度的复用显微镜方法来了解健康和疾病组织的复杂性。在最近的一个例子中，超过50种蛋白质被可视化，以揭示不同的细胞邻域如何协调免疫肿瘤微环境的空间组织，并促成结肠直肠癌的结果。
6.1 扩展功能和范围
抗体长期以来一直是原位蛋白质检测的支柱，但它们是不完善的工具，需要仔细的表征和经验优化，这使得复用实施变得繁琐。它们是大分子，其扩散、靶标进入和结合过程对样品制备条件高度敏感，并且很少可获得关键的生物化学表征信息，例如抗体蛋白序列、稳定性、确切的表位或结合动力学。重组抗体的广泛使用，更多的纳米抗体的选择，以及适体和工程化结合剂等替代探针，都有可能在未来使复用抗体组合的创建变得更有效和更低成本。另外，采用复用的信号放大方法（如上所述）和更亮的纳米发射器作为常用有机染料的替代品，将提高复用实验的检测灵敏度。
预计进一步的改进包括：提升重复性，自动化的端到端工作流程，在单个实验实现更多的标记，更大的可成像区域以及来自复用成像领域之外的灵感。值得注意的是，最近的一项研究结合了天文学的原理，以帮助从基于六重TSA的人类黑色素瘤样品成像分析中收集高质量的数据集。由此产生的工作流程——AstroPath，为操作员独立的现场选择提供指导，并为多光谱成像中的常见问题提供了解决方案，包括图像处理伪影、不恰当的图像分割和分类，以及由于标记物强度的变化而产生的批次效应。重要的是，这些原理可以扩展到这里描述的高内涵成像分析。另一个令人兴奋的发展领域涉及针对特定细胞类型和亚型的复用图像的计算/自动分割，以实现组织范围的细胞群评估。为此，HuBMAP consortium投入了大量资源来比较现有的细胞分割算法在复用成像平台和定义的数据处理流程中分割膜和核的能力。与描述用于细胞分割的许多方法相比，我们分割整体功能单元（例如肾脏内的肾小球或心脏中的心室）的能力并不先进。单个细胞在功能上很重要，同时它们在解剖结构内的积极协调，对于整个器官功能也是至关重要的。复用显微镜方法是推进这一领域的关键，因为通常需要几个标记来完全定义结构，且自动化可以快速分析大块组织。最后，在较厚的体积中有效实施这些分析方法将大大推进器官水平的研究。
6.2 处理数据：标准化，重复性和存储的挑战
虽然增加的参数深度对于理解复杂的哺乳动物系统至关重要，但每个循环或蛋白质生物标志物都提供了额外的数据，通常会导致数TB大小的原始显微镜图像。因此，在传输、存储和共享原始数据方面存在相当大的挑战。这些数据集提出了挑战，因为复用实验通常需要专有软件，并且可以根据捕获的周期、标记和样品的数量进行扩展。仅数据集的庞大规模就为存储和处理带来了独特的挑战。例如，10个周期的CODEX实验（200 tiles，11 z-stacks，20×物镜）的原始数据>1.5 TB（150 GB/周期，包含3个探针和DAPI）。许多数据库或资料库在不给作者或期刊带来相当大的成本的情况下，不会存储如此大的数据，这就阻碍了开放的数据共享。压缩、扩展景深和重叠裁剪等处理步骤将大大减小文件大小（使用上述示例约为290 GB），但这涉及修改图像，阻碍了他人使用改进的算法和软件重新处理原始数据。此外，数据分析和处理步骤应该是透明的，例如报告特定的分析元数据或处理标准，以提高最终数据集的重复性，以及符合FAIR数据报告标准的可靠性。HTAN联盟最近提供了详细的指南和参考资料，用于记录复用组织成像元数据的结构化数据库。数据集最有价值的方式，就是能以开放或非专有的格式提供，如OME-tiff或BDV，就能免费获得标准化格式的数据集。作为替代方案，原始数据（状态0）可以使用长期存储或存档解决方案（便宜但缓慢），而更高级别的数据状态可以在更易访问的存储解决方案上维护（更昂贵但更易于访问（补充）表6））。
由于用于获取和处理数据的不同方法和工具，加剧了管理这些大型数据集的挑战。解决这个问题需要标准化的、非专有的格式和共同的基础设施来分享和保存数据。我们看到采用开放科学文化和国家，或国际资助和管理的大型数据库组织（如HuBMAP数据门户网站和癌症影像数据库）的价值。这一努力肯定需要所有利益相关者的共同努力，包括资助机构、出版商、方法开发人员、生物技术公司（将这些方法商业化为硬件、软件和化学产品），以及利用这些资源的科学家。
6.3 从多重成像到测序
随着复用成像方法与流式细胞仪、CITE-seq、质谱、转录组学和光谱学等正交模式的整合，使产生的数据更接近已建立的“组学”是至关重要的。结合这里讨论的复用抗体建议，将提升细胞类型的表征效果，并有可能导致发现新的细胞（亚）类型。除了对新发现的独立验证之外，这种多模式分析将能够同时测量单个细胞类型的基因表达和蛋白质产物，并允许更好地理解复杂组织中细胞的生理功能和相互作用蛋白。除了这里介绍的复用成像方法之外，诸如DBit-Seq和Digital Spatial Profiling的新技术还提供空间定义的核苷酸条形码集合，并能利用测序平台实现复用蛋白质检测。这里描述的最佳做法也基本适用于这些混合方法，而且不同的考虑可能适用于亚细胞采样和基于测序的目标检测。
结论
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC9264278/
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