20年来研究进展综述|华中农业：鸡蛋蛋白质组的发现和应用（国人佳作）
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编译：微科盟，编辑：微科盟Emma、江舜尧。
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导读鸡蛋以及含有鸡蛋成分的各类食品是为人体提供营养的重要蛋白质来源之一。此外，鸡蛋中还蕴藏着大量生物活性物质，在医药、食品、化工领域具有极高的经济价值。然而，经过半个多世纪的研究,鸡蛋中仍只有一些主要的蛋白质被鉴定出来，那些微量的蛋白质还不为人们所知。鸡蛋蛋白质在各种条件下会发生许多潜在的变化，这可能会进一步改变蛋白质的营养价值、理化性质和生物活性。近年来，随着基因组学的发展和高通量蛋白质组学研究方法的不断进步，使得从整体上系统地研究鸡蛋各部位的全套蛋白质以及其相互作用成为可能，对不同物种生鸡蛋蛋白质组以及孵化过程中发生的动态变化相关的研究也正在迅速发展。本综述全面概述了鸡蛋蛋白质组的主要特征，涵盖了其在各种条件下的所有成分和应用，并展望了未来该领域研究的发展趋势和应用前景，不仅有助于我们深入了解蛋白质组的各个组成功能，也为蛋品行业提供了有价值的信息。
内容梗概1.本文描述了从基于凝胶到基于质谱的蛋白质组学方法的改进。2.蛋白质组学能够对完整或动态的蛋白质组进行大规模分析。3.本文首次综述了不同条件下的鸡蛋蛋白质组学研究成果。4.蛋白质组在标志物检测、质量评价、营养补充等方面有重要作用。
论文ID
原名：Unveiling and application of the chicken egg proteome: An overview on a two-decade achievement译名：鸡蛋蛋白质组的发现和应用:20年来的研究进展综述期刊：Food ChemistryIF：9.231发表时间：2022.06通讯作者：邱宁
通讯作者单位：华中农业大学食品科学技术学院
主要内容
1. 引言
鸡蛋不仅是满足胚胎发育所有要求的密封产品，而且是一种营养丰富、营养均衡、生物利用度高的完美食品。生鸡蛋和新鲜鸡蛋由水（76.1%）、蛋白质（12.6%）、脂质（9.5%）、碳水化合物（0.7%）和灰分（1.1%）组成，它们分别分布在蛋壳、蛋清、蛋黄、卵黄膜和卵带上，这也是鸡蛋的不同组成部分。蛋清(10.9 g / 100 g)和蛋黄(15.9 g / 100 g)中含有大量的蛋白质，其中包括卵黄膜，这些参数随母鸡的年龄和遗传背景略有变化。鸡蛋作为鸡胚胎体外发育的所有营养来源和保护屏障，含有胚胎发育所需的所有蛋白质、维生素、脂肪和矿物质等。同时由于鸡蛋中各氨基酸的比例均衡，非常利于胃肠道的吸收，也是人体必需的食品。除此之外，鸡蛋各部分所特有的理化性质及其含有的各种生物活性分子使其成为医药、食品乃至化妆品等领域重要的原料来源。虽然对鸡蛋各部分主要蛋白的分离纯化研究已经历了半个多世纪，但对鸡蛋中微量蛋白的鉴定和认识始终没有取得突破性进展。
到目前为止，许多研究已经强调了鸡蛋不同部位蛋白质的重要性，以及它们在营养、功能和生物活性方面的重要作用。例如，鸡蛋蛋白被认为是高质量的蛋白质，并被用作衡量所有其他食物蛋白质质量的金标准。此外，鸡蛋中的必需氨基酸和蛋白质也被用作有价值的食品成分，因为它具有突出的凝胶化、乳化和成型性。此外，鸡蛋蛋白的另一个重要作用来自于不同的鸡蛋衍生蛋白和相关肽，它们具有各种生物功能，如抗菌、抗氧化和抗癌特性。例如，从蛋清中分离出来的溶菌酶，已经被用作食品防腐剂，以对抗致病菌。而蛋清中的另一种蛋白质卵转铁蛋白，由于其抑制肿瘤的能力，已被用作抗癌剂。从蛋黄中分离出的磷维素具有良好的抗氧化性能，已被作为一种天然的补充剂来限制氧化过程对食品的不利影响。如前文所述，研究人员目前只发现了几种分离出来的鸡蛋蛋白具有重要的功能，仍然存在着各种未知的蛋白，它们可能发挥着有价值的功能，尤其是那些可能在组织完整性和生物活性方面发挥作用的低分子蛋白和多肽，如对蛋壳基质形成起作用的凝集素，以及具有较强抗氧化活性的小肽。显然，有必要对所有鸡蛋蛋白进行更全面的了解和鉴定。
蛋白质组是生物样本中存在的整组蛋白质，与静态基因组相比，它是高度动态的。蛋白质组学已成功应用于食品科学的多个领域，通过比较不同类群间的差异蛋白，以及利用各种生物信息学工具进行分析，进行标记蛋白搜索、食物过敏原鉴定、营养特性的系统分析和食品质量的改善。在食品鉴定中，蛋白质组学的目的是寻找标记蛋白。基质辅助激光解吸/电离(MALDI)质谱分析技术已广泛应用于肉类和乳制品的鉴定。蛋白质组学是研究食物过敏原的主要工具，主要使用两种不同的策略:基于二维聚丙烯酰胺凝胶电泳(2DE)的方法和基于高效液相色谱的无凝胶方法(图1)。在食物过敏原研究中，蛋白质组学方法主要涉及蛋白质提取、目标过敏原鉴定和过敏原定量。考虑到食品的蛋白质组成，蛋白质组学是食品工业的一个非常有效的工具，它不仅从营养的角度揭示蛋白质的功能(如氨基酸的组成)，而且有助于从生物活性的角度识别食品中的功能成分。例如，人类乳汁的蛋白质组学强调了不同的蛋白质成分，以及乳汁在整个哺乳过程中的功能，包括提供营养物质和增强认知发育、生长、肠道成熟和免疫防御。
近年来，鸡蛋蛋白质组学为全面发现新型蛋白质提供了高效的解决方案，并提供了各种条件下蛋白质的实用和理论信息。蛋白质组学作为功能基因组学研究领域的一个重要分支，在赋予基因功能，阐述生命现象本质等方面发挥着重要作用。在本文中，我们将通过蛋白质组学介绍对鸡蛋蛋白质的最新进展。
2. 影响鸡蛋蛋白质组成的自然因素
许多因素决定了鸡蛋蛋白质的组成，通过影响蛋白质的迁移、水解、聚集和翻译后修饰，可以进一步改变上述蛋白质的生物利用度、功能和生物活性。接下来。我们首先详细介绍影响鸡蛋蛋白质的几个关键因素。
2.1 种间变异
众所周知，鸡蛋主导着全球餐桌蛋市场。然而，鸭蛋和鹌鹑蛋在亚洲、拉丁美洲和欧洲的一些国家也被广泛食用。由于长期的环境适应和进化，各种鸟类确实具有影响蛋白质功能的不同模式。例如，据报道，鸭蛋和鹌鹑蛋的蛋清蛋白含量高于鸡蛋。此外，不同禽种鸡蛋中某些特定的卵白蛋白肽的氨基酸序列差异为了解同源蛋白在进化过程中的氨基酸多样性和对不同环境的适应提供了一个很好的模型，这可能反映了蛋白质在长期进化过程中避免进化错误的保护机制。此外，鸭溶菌酶对肠炎沙门氏菌的抑制作用强于鸡溶菌酶，这可能与鸭溶菌酶在长期的湿度压力和较高的细菌负荷环境下的进化有关。因此，不同种类鸡蛋蛋白的多样性对其组成、功能和生物活性具有不同的影响。
2.2 鸡蛋储存
鸡蛋在贮藏过程中发生的变化，如白蛋白变薄、卵黄膜变弱、蛋白质构象改变等，可发生在鸡蛋的几乎所有部位，并可显著降低鸡蛋的质量和货架期。研究表明，与新鲜鸡蛋相比，蛋黄蛋白中脂维蛋白、蛋黄蛋白C含量较低，而脂维蛋白C含量较高，其中蛋白质讲解可能会显著降低鸡蛋的货架期。鸡蛋蛋白质在贮藏过程中的降解对鸡蛋品质有重要影响。随着时间的推移，蛋清变薄是鸡蛋质量下降的一个明显迹象，这似乎是卵白蛋白连接的碳水化合物的结构解放和破坏的结果。在贮藏过程中，卵清蛋白会逐渐转化为S-卵清蛋白，这是一种不可逆的热稳定形式，会影响卵清蛋白的天然功能和全卵系统的功能。虽然卵黄膜只占整个鸡蛋的一小部分，但其结构蛋白对膜的完整性起着至关重要的作用，在贮藏过程中，卵黄膜的结构蛋白大量解体，但在长时间贮藏和热贮藏过程中，蛋白质稳定性下降会导致卵黄渗出。
2.3 鸡蛋胚胎发育
除了对人类的营养价值外，鸡蛋蛋白的最初作用是满足发育中的胚胎的保护和营养需求，这为了解发育中的胚胎的营养需求提供了潜在的见解。鸡胚发育可分为3个阶段:第一阶段(孵化第一周)胚、绒毛膜囊和尿囊腔的形成;胚胎发育的完成发生在第二阶段(第8天至第14天)，依赖于从蛋清和蛋黄中恢复的营养;最后一个阶段是孵化准备阶段，营养物质被胚胎快速吸收。胚胎发生的过程涉及到鸡蛋蛋白质的组成和功能的转变。例如，内源酶可以将一些鸡蛋蛋白降解为氨基酸或多肽以便胚胎更好地吸收，而卵清蛋白在孵育过程中会发生构象变化。此外，据报道，溶菌酶的酶活性在孵化的前12天下降。
2.4 其他因素
其他因素，如母鸡的生理状况(如年龄、应激和免疫状况)、营养和饲养系统(如饲料组成、饲料质地和交付方式)也会影响蛋白质成分。鸡蛋中蛋白质等宏观成分的含量比较稳定。然而，主要的生理状态和饮食影响与整体鸡蛋质量(如鸡蛋的数量和重量)以及蛋清和蛋黄的比例有关。大量的研究表明，各种条件会导致鸡蛋蛋白质丰富而微妙的变化。通过综合比较，需要确定不同条件下鸡蛋蛋白的具体特性和功能，另外，在各种条件下具有活性的已鉴定蛋白质数量有限。鉴定涉及鸡蛋质量退化、液态蛋掺假或对有益于人类健康的生物活性分子蛋白质的开发仍然是一项挑战。
3. 鸡蛋蛋白质组的描述
过去二十年在鸡蛋蛋白质组学领域取得了重大进展（表1），主要是因为基于凝胶的蛋白质组学向基于质谱（MS）的高通量蛋白质组学的转变（图1）。对于蛋白质分离，基于凝胶的方法，特别是2DE，可用于可视化蛋白质信息，例如蛋白质质量、等电点和翻译后修饰(PTM)，这些信息在早期广泛使用。此外，2DE和MS 的结合有助于可视化和识别在某些条件下差异调节的卵蛋白。然而，由于基于2DE 的蛋白质组学的局限性，包括检测微量蛋白质的能力较弱、线性动态检测范围窄、过程耗时、样品处理量大和重现性低，研究人员开发了色谱技术来实现直接、自动进样和蛋白质（或肽）复合物分离。这种新的分离方法随后促进了鸟枪法蛋白质组学的发展，通过将肽片段化的串联质谱与数据库与源自许多计算机消化蛋白质的肽的理论串联质谱进行比较，可以间接测量蛋白质。用于鸟枪法蛋白质组学的高级MS 和数据分析软件促进了高通量蛋白质组学分析，例如基于无标记方法的蛋白质组学、串联质量标签和用于相对和绝对定量的等压标签。
表1 5年内发表的鸡蛋蛋白质组研究列表用于研究蛋清蛋白质成分的工具库得到了基于质谱的蛋白质组学技术的补充。这些快速而灵敏的方法的应用已经能够鉴定出大量新的蛋清蛋白。随着从基于凝胶的蛋白质组学向基于质谱（MS）的高通量蛋白质组学的转变，如今检测到的鸡蛋蛋白数量也从几十个增加到几千个。例如，早期的比较蛋白质组学研究主要是基于二维电泳的差异分析，而现在基于质谱的方法使用多种可选择的稳定同位素标记两个或多个不同样品的蛋白质，然后混合分析样品，质谱的高质量和准确性可以分离同位素进行相对定量，从而促进了PTMs组学的进展。而且，近年来，随着生物科学研究的深入，逐渐发现生物样本存在组织异质性和空间差异性。蛋白质组学的研究趋势使纳米蛋白质组学从传统的整个组织发展到研究微细胞群（小于5000个细胞）甚至单细胞，从而获得更准确的生物系统信息。此外，基于新一代tims TOF Pro质谱平台（基于3D分离（保留时间、m/z、离子强度）），降低了样品复杂度，提高检测灵敏度，多方面全面提升检测性能，使蛋白质组学进入4D新时代。
3.1 蛋清
鸡蛋蛋清是一种高黏度的液体，含有11%的蛋白及糖蛋白。除了为蛋黄提供一个减震的环境外，蛋清也为胚胎的发育提供了水分、蛋白质和其他营养，而且还具有胶凝、乳化和发泡特性。此外，一些蛋白质，包括卵清蛋白和卵转铁蛋白，广泛用于生物医学研究和蛋白质化学。因此，鸡蛋清一直是蛋白质组学的研究对象。20年前首次分析了鸡蛋清的蛋白质组，通过使用不同的电泳分离方法对蛋白质组成进行了比较研究。研究人员通过使用等电分离法可视化卵清蛋白、卵转铁蛋白和卵粘蛋白的同工型。虽然有很多点未知，但大量的蛋白质点被2DE分离出来，这是随后对蛋白质组进行综合分析最有效的分离方法。另一项研究报道了16种新蛋白质，并通过基于2DE的分析对蛋清中蛋白质多态性和功能性蛋白质家族的鉴定做了进一步的分析。这些结果表明，蛋清中有更多的新蛋白质需要被鉴定。
2007年的研究共鉴定出78种鸡蛋清蛋白，其中54种是通过液相色谱（LC）-MS/MS和MS3联合方法发现的。通过限制高丰度蛋白质对微量蛋白质鉴定的阻碍作用，使用两种类型的肽配体库，可以鉴定出148种蛋清蛋白。后来，研究人员报道了一种新的识别方法，使用线性离子阱Orbitrap分析器，该仪器速度足够快，可以同时分离和破碎多峰，并获得高分辨率质量全扫描光谱。早期基于2DE的蛋清蛋白质组研究中，发现大量同种蛋白质具有不同分子量或不同等电点值的蛋白质同型，主要通过糖基化和磷酸化修饰。鉴定糖蛋白和糖位点的组学策略通常依赖于酶消化、糖肽富集、糖肽去糖基化和MS/MS鉴定。研究报道了26种鸡蛋清糖蛋白中的71个N-糖苷脂，其中卵粘蛋白作为糖基化程度最高的蛋白质，被认为具有一定的抗病毒活性。后来，通过胰蛋白酶和胰蛋白酶/谷氨酰内蛋白酶消化结合固定化金属亲和层析，从96个磷蛋白中共鉴定出189个磷酸位点，表明胰蛋白酶消化可以大大提高蛋白质的识别率。此外还有一些蛋白质虽然在蛋清中首次发现，却广泛存在于鸡的血浆和脑脊髓液中，这些蛋白包括血清蛋白、腱糖蛋白、免疫球蛋白、胞外脂肪酸结合蛋白、阿朴脂蛋白、谷胱甘肽过氧化物酶等。与蛋壳类似，蛋清中还含有一些胞内蛋白，例如肌动蛋白、泛素蛋白、组蛋白等，这些蛋白可能来源于输卵管内层衰老的上皮细胞。大部分蛋清中的蛋白也同时存在于蛋壳基质中，但在蛋清中没有发现蛋壳的特有蛋白。说明这些蛋壳特有蛋白可能是在鸡蛋进入输卵管的蛋壳腺体区域后才被合成、分泌并组装的。最近，各种高通量肽组学研究发现了蛋清中的一些天然功能性肽，并推动了功能性食品和药用化合物的开发。使用蛋清蛋白质组学、肽组学和PTM 组学，将发现更多的蛋白质及其相关功能。这些蛋白质在食品生产和营养补充剂中的应用应该是未来研究的一个重要方向。
3.2 蛋黄和卵黄膜
鸡蛋的蛋黄被卵黄膜(三层蛋白质细胞外基质)包围，与蛋清分离开来，为胚胎的发育提供脂质、蛋白质、维生素和矿物质。蛋黄中含有48%的水分，33%的脂质以及17%的蛋白质。蛋黄中的蛋白和脂蛋白主要分布在两个部分：蛋黄的浆液部分含有水溶性蛋白，如α卵黄蛋白（血清白蛋白）、β 卵黄蛋白（a2醣蛋白）、γ 卵黄蛋白（IgY），蛋黄的颗粒状部分主要含有卵黄磷蛋白，如高密度的卵黄高磷蛋白和低密度的脱辅基蛋白。除了这些主要的蛋白以外，蛋黄中还含有很多的酶类、维生素结合蛋白、α2 巨球蛋白、C 型外源凝集素家族的三聚体蛋白。为了对蛋黄中的蛋白质进行系统的识别和全面的鉴定，研究人员采用了基于LTQ-FT质谱的多级质谱鉴定方法，报道了119个蛋白，其中发现了86个新蛋白。大部分蛋白质均存在于血浆和颗粒中，但其数量差异较大。与研究蛋清蛋白质组的方法类似，利用肽配体库的组合效应，避免了高量蛋白的干扰，将已鉴定的蛋黄蛋白数量增加到255个。在这些蛋白质组学研究的基础上，对蛋黄蛋白进行生物信息学分析，揭示了蛋黄蛋白在细胞间相互作用、细胞发育和增殖以及血液系统发育等方面的作用。
目前，进行了大量的蛋黄蛋白质组学研究，确定了丰富的蛋白质。在2018年进行了首次全面的多肽研究，共鉴定出628个天然多肽，这些多肽有望成为新型生物活性化合物(如抗菌、降压、抗病毒、抗炎等)、功能性食品和化妆品。此外，多肽研究还预测了PTMs的发生，PTMs对蛋白质结构、理化性质有重要影响。此后，研究人员首次对鸡蛋黄进行了全面的n -糖蛋白组学分析，从217个n -糖基化位点和86个糖蛋白的分析中获得了对食品加工和胚胎发育有价值的结构信息。采用高通量高端LC-MSn方法，从鸡蛋卵黄膜中鉴定出137个蛋白，卵黄膜是防止微生物感染的屏障，也是防止蛋黄与蛋清混合的结构。卵黄膜上的主要蛋白如溶菌酶C、卵黄蛋白、卵白蛋白、卵转铁蛋白等也存在于卵黄膜上，而其他蛋白包括8种ZP蛋白、2种ATP酶、卵黄蛋白蛋白酶等仅存在于卵黄膜上。这些结果揭示了卵黄膜中蛋白质来源的多样性，尽管我们对这些蛋白质和翻译后修饰的了解仍然不完全。最近，一项对鸡蛋卵黄膜的N -糖蛋白组研究报道了208个N -糖蛋白中的435个N -糖苷，其中一些可能调控蛋白酶/抑制剂，并在脂质跨膜转运中发挥作用。对于蛋黄以及卵黄膜中全蛋白质组学的研究目前还是起步阶段，这些蛋白成分的来源、功能、彼此之间的互作关系以及在胚胎发育中的重要作用都将是未来研究的重要方向。
3.3 蛋壳
鸡蛋的蛋壳是一种多孔的石灰质硬壳，其约占全蛋质量的12%~13%。蛋壳能够保护鸡蛋免受外界的物理损伤以及微生物的侵染，在胚蛋的孵化期调节空气和水的交换，并为胚胎发育提供钙质。蛋壳由三部分组成，最外层的角质层、钙化层和最内层的蛋壳膜。蛋壳的形成是个生物矿化的过程，在这个过程中，有机基质如蛋白、糖蛋白、蛋白多糖、多聚糖等起着不可或缺的重要作用。蛋壳的生物矿化主要发生在壳腺中，这里含有过饱和的钙和碳酸盐以及构成蛋壳有机基质的有机前体物。蛋壳的生物矿化主要发生在壳腺中，这里含有过饱和的钙和碳酸盐以及构成蛋壳有机基质的有机前体物。通过酸处理，蛋壳中大约一半的有机基质处于可溶状态，通过高效液相色谱分离和质谱鉴定（LC-MS），确定的蛋白数量多达 520 种，除10 种已报道的蛋白外，其他都是新发现的。这些蛋白可大致分为三类：第一类是蛋清中也存在的蛋白或糖蛋白，例如卵清蛋白、卵转铁蛋白和溶菌酶，这些蛋白并非蛋清的污染物，而是内植于矿物层中；第二类是在鸡体内存在的蛋白，如骨桥蛋白、簇蛋白和血清蛋白等；第三类是蛋壳中所特有的蛋白或蛋白聚糖。
蛋壳特异性蛋白质、卵清蛋白和卵清蛋白，以及蛋壳腺细胞产生的其他蛋白质，可能在蛋壳形成过程中发挥特定的作用。然而，该研究仅用于鉴定蛋壳钙化层中的蛋白质，并未提出其可能的功能。随后，其他研究回顾了蛋壳基质的组学分析，并有助于我们了解这些蛋白质对蛋壳形成和功能的影响。这两种蛋壳特异性基质蛋白被认为在矿化和抗菌防御的调节中发挥作用。后来，对蛋壳最外层的蛋壳角质层进行了第一次蛋白质组学分析。LC-MS/MS 共鉴定了47种蛋白质。Ovocalyxin-32和一种类似于Kunitz样蛋白酶抑制剂的蛋白质是角质层中最丰富的蛋白质，该研究首次报道了蛋壳角质层的综合蛋白质组，并为其抗菌特性奠定了分子基础。蛋壳膜是蛋壳的另一个重要组成部分，保护鸡蛋免受病原体感染。由于蛋壳膜具有广泛的交联和稳定的特性，蛋白质的鉴定在技术上具有挑战性，需要各种提取/溶解条件来进行蛋白质组学分析。另外，需要验证PTMs对蛋壳成分的影响，因为它们可以极大地改变蛋白质的性质和相互作用。蛋壳基质中的低丰度蛋白占据了总量的80%左右，其中有很多蛋白尤其是信号转导蛋白和一些酶类如骨桥蛋白等在蛋壳形成过程中起着重要的作用。2007年，研究人员利用LC-MSn在蛋壳基质中鉴定了39个磷蛋白，其中22个是新发现的。磷酸化等PTMs常常通过蛋白质相互作用影响蛋壳底物的组装。对鸡蛋壳基质的蛋白质组、磷蛋白组和糖蛋白组进行了系统分析，发现182个N -糖蛋白上有297个N -糖基化位点，69个磷蛋白上有112个磷酸化位点。N -糖蛋白主要参与免疫应答的调节，磷蛋白主要参与酶活性的调节。虽然在蛋壳基质中发现了如此多的蛋白，但对于这些蛋白的具体功能大都还停留在预测阶段。类似磷酸化这种翻译后修饰往往能通过蛋白质间互相作用来影响蛋壳基质的组装过程。基于蛋壳基质的全蛋白质组学研究为进一步揭示这些蛋白的功能开辟了新的道路。
4. 不同条件下鸡蛋蛋白质组学的变化
由于对单个蛋白质组的绝对描述是不可行的，比较蛋白质组学主要试图破译两种或多种不同条件之间的差异。比较蛋白质组学技术是一种有效的工具，不仅可以鉴定静态的鸡蛋蛋白质组，而且可以为深入了解鸡蛋蛋白质组的动态性质提供依据。在本节中，我们介绍了鸡蛋蛋白质组比较研究的主要应用(图2、表2)。
表2 五年内蛋白质组学在鸡蛋蛋白质营养和功能研究中的进展
4.1 鸡蛋蛋白质组学在标志物检测中的应用
现在，液态蛋越来越受欢迎，但与有壳鸡蛋不同，在产地、纯度、新鲜度等方面可能会掺假，而且不容易鉴别。事实上，掺假的液态蛋可能会由于鸡蛋过敏而造成潜在的健康风险。许多研究报告了人类群体中不同的种间过敏反应。因此，需要对不同禽蛋进行蛋白质组学比较分析，以确定每种禽蛋的特定蛋白质模式，以确保食品安全和质量。鸡、鹌鹑和鸭的比较模式表明，2D凝胶上的一些蛋白质特异性区域可用作来源真实性的生物标志物。在过去的几年里，MALDI质谱在食品工业中发挥了至关重要的作用，特别是在识别食品掺假、表征食品过敏原以及调查各种条件下诱发的PTM方面，这可能是食品安全和质量方面的一个问题。据报道，选择基于MALDI 的蛋白质组学分析可能是高通量筛选假定鸡蛋过敏原的合适方法。此外，蛋白质组学方法已被广泛用于寻找食品质量和储存过程中变化的生物标志物。凝聚素是一种在基于2DE 的蛋白质组中鉴定的蛋白质，在高温储存条件下会减少，并被提议作为鸡蛋行业评估鸡蛋质量的有效生物标志物。此外，通过综合多肽技术鉴定鸡蛋新鲜度的生物标志物，分别从蛋黄血浆和蛋清中发现1974和836个独特的可变分子。采用严格的数据筛选标准，并通过无标记基础的蛋白质组学进行验证，共筛选出25个(蛋黄)和19个(蛋清)肽作为鸡蛋衰老的标记。为了预测鸡胚的低孵化率和低死亡率，通过串联质量标记定量蛋白质组学鉴定了11个蛋白质生物标志物，并提出它们在胚胎发育中发挥作用，有助于我们更好地理解胚胎生长发育。
4.2 鸡蛋蛋白质组学在质量评价中的应用
有壳鸡蛋的市场为消费者提供了许多选择，通过饮食干预改变了鸡蛋的营养成分(例如，富含omega-3、硒和维生素D的鸡蛋)。通过对6个鸡蛋品种的2DE蛋白质组学分析，共发现23种蛋白质，其中19种蛋白质含量差异显著。不同家禽品种也有类似的结果。此外，在5个家禽品种发现，189种蛋清蛋白存在差异。这些研究表明，从蛋白质组成上看，不同种类鸡蛋的蛋清营养品质没有明显差异。然而，为了验证鸡蛋蛋白的物种特异性多样性，利用无标记蛋白质组学对两种鸡蛋黄蛋白进行了比较，发现其中一种具有较高的抗氧化能力，这可能与PIT54和谷胱甘肽过氧化物酶3蛋白有关。此外，另一项磷酸化蛋白质组研究表明，一些鸡蛋蛋白具有更强的抗氧化、抗菌和乳化特性。通过跨物种和品种的比较，这些研究结果全面了解了蛋白质的生物活性，为研究磷酸化对鸡蛋蛋白质营养特性的影响提供了新的思路。除了藏蛋蛋白的PTMs外，与脂质运输和代谢相关的蛋白质(如卵黄原蛋白、载脂蛋白A-I和血清白蛋白)也具有显著的相互作用，可能被用作应对低温缺氧环境的最佳生存策略。这些发现表明，不同品种的鸡可能通过长期适应环境和进化来调节鸡蛋蛋白质的丰度，而不是蛋白质的组成。此外，在这些适应过程中，一些蛋白质的活性也会通过经颅磁刺激诱导的三维结构和生物功能的改变而增强。
在许多发展中国家，没有冷藏(温度低于10摄氏度)储存鸡蛋的监管要求，而且随着储存时间的延长，鸡蛋的质量会下降。环境条件、温度和贮藏时间对生鸡蛋的品质和功能特性都有影响，主要是通过影响鸡蛋内部的隔层。近年来，蛋白质组学方法被用于测定鸡蛋贮藏过程中蛋白质水平的变化，以更好地了解鸡蛋品质下降的机制。对蛋清的蛋白质组学分析表明，对于大量的蛋白质，如卵清蛋白、卵抑制蛋白和卵转铁蛋白，在初始储存期间蛋白质的数量发生了很大的变化，而进一步的储存会导致蛋白质组的微小变化。本研究提示，在长期贮藏过程中，卵白蛋白和聚集蛋白的降解可能是导致蛋清变薄的原因。另一项基于2DE的蛋白质组学研究着重于不同储存温度(4、20和37℃，持续15天)对蛋清的影响，结果表明，卵白蛋白的降解可能是由于抗蛋白酶的减少，进一步揭示了鸡蛋品质恶化过程中热诱导的生化变化。采用2DE蛋白质组学比较方法，利用MALDI-TOF-MS/MS发现了贮藏40 d后蛋黄蛋白质的变化。大多数蛋黄蛋白呈现一定程度的降解，随时间的推移而加速。进一步研究了不同贮藏温度(4℃和37℃，贮藏15d)下蛋黄蛋白磷酸化状态。大多数磷酸化程度增强的蛋黄蛋白可能参与了与鸡蛋变质相关的催化、结合和运输功能。通过蛋白质组学和N -糖蛋白组学的比较分析，研究30℃保存10天后鸡蛋卵黄膜的变化，发现结构蛋白和相关糖苷的变化，这可能是由于纤维结构的损失，导致膜在高温保存过程中恶化的结果。从这些蛋白质组学研究来看，主要白蛋白抗蛋白酶(如卵黏液、卵抑制蛋白和卵抑素)的降解被认为是解释贮藏过程中蛋清变薄的机制。此外，在贮藏过程中，聚糖的释放导致卵母蛋白的解聚，被认为是导致蛋白凝胶结构变薄的主要原因。
4.3 应用鸡蛋蛋白质组揭示遗传和生物学未知的多样性
随着家禽遗传进化和驯化的悠久历史，不同的禽类物种呈现出独特的遗传特征，它们的蛋在许多方面都有所不同，包括蛋的大小、蛋的组成、理化性质和营养成分。因此，来自不同家禽物种的鸡蛋蛋白质的比较蛋白质组学分析提供了破译与蛋白质相关的物种特异性生物学未知数的可能性，并且可以帮助我们了解进化关系以及指示对环境的适应水平。例如，从三种家禽物种中鉴定出的蛋黄蛋白在蛋白质序列和结构上具有高度的同源性，这被认为与鸟类对不同环境胁迫的适应性有关。而另一项对鸡、鹌鹑和鸭的蛋清的比较蛋白质组学研究发现，鸭蛋清中有两种特定的蛋白质(恶性脑肿瘤缺失蛋白1和卵黄原(VTG)-2)。与鸡肉相比，鸭蛋蛋白在2D凝胶上的分布具有多样性，而鹌鹑蛋白与鸡肉蛋白在2D凝胶上的分布模式更为相似。从这些蛋白组模式来看，物种间的多样性可能与蛋白质的特定功能需求有关，如微生物防御和胚胎发生调控。利用串联质标记技术对6种主要家禽蛋清进行了蛋白质组学研究。不同物种鉴定出的蛋白质数量不同:鸡148、鸭138、鹌鹑183、火鸡162、鸽179和鹅150。在这6个物种中，共有52种保守蛋白，其看似合理的功能似乎可以防止胚胎细胞的早期死亡，并为胚胎发育提供安全的环境。与此相反，本研究筛选出了鸽触珠蛋白等与某些物种依赖的生物学过程相关的物种特异性蛋白。该研究对我们理解物种特异性的生物作用具有指导意义，并从蛋白质组学的角度对进化/驯化过程提供了一些见解。由于蛋白质之间不同的翻译后修饰可以进一步反映其功能的差异，因此我们对鸡蛋PTMs进行了种间比较。研究人员对鸭蛋蛋白和蛋黄进行了N-糖蛋白组分析，并与鸡蛋同源物进行了比较。进一步证明了物种特异性过敏原性、抗菌能力和抗病毒特性可能与蛋白质糖基化的差异有关。
同时，本课题组还研究了鸭蛋的磷蛋白信息，并将其与鸡蛋进行比较，寻找生物适应性的线索，提出鸭蛋蛋白的一些生物活性（如抗菌和抗氧化能力）高于鸡蛋。此类工作促进了各种来源的鸡蛋蛋白的应用，并有利于食品工业中功能性食品的开发。此外，鸡蛋（也可以看作一个细胞）的变异和进化速度比鸡更容易和更快。鸡蛋中丰富的蛋白质，以卵清蛋白为例（约占蛋清蛋白的54%），由于一系列PTMs而具有结构异质性，其中卵白蛋白的结构异质性可能只是其高丰度和高丰度的结果。在长期进化过程中维持蛋白质活性以防止卵子变异的保护机制。此外，由于环境污染的选择压力较高，蛋白质稳定性较低，蛋清的蛋白质适应速度似乎比蛋黄快。
4.4 胚胎发生过程中营养运输和器官形成的鸡蛋蛋白质组学研究
鸡蛋在胚胎发生过程中起着至关重要的作用，既可以满足胚胎的营养需求，又可以保护其免受微生物感染。尽管已经提出了不同卵清蛋白在胚胎发育过程中的生物功能，但并未研究这些蛋白质在孵化过程中的变化。需要在蛋白质组水平上对卵清蛋白进行系统表征，以揭示它们在胚胎发育过程中的动态变化，因为这项工作可能会进一步揭示它们在发育胚胎的生理和营养支持中的作用，尤其是与营养运输有关的作用和器官形成。此外，在孵化过程中研究鸡蛋蛋白质也很重要，因为它不仅可以构成研究胚胎营养的合适模型，还可以让我们深入了解胚胎发育过程中健康或疾病的起源。一些蛋白质组学分析揭示了未受精卵和受精卵之间的一些差异，特别是卵清蛋白相关蛋白Y、富含组氨酸的糖蛋白和载脂蛋白B，它们在卵子受精的动态过程中发挥了重要作用。2012年，第一个受精卵在孵化过程中的蛋白质组学研究确定了蛋白质的8个显着变化。观察到卵清蛋白的广泛降解，这表明它除了作为营养物质外，还具有重要的生物功能。后来，研究人员鉴定了11 种卵清蛋白，例如胚胎发生过程中细胞结构中的角蛋白，这可以预测低孵化率和早期胚胎死亡。在过去的几年里，人们对孵化过程中蛋黄中发生的蛋白质变化进行了广泛的研究。研究通过比较受精和未受精的鸡蛋，分析了孵化第12 天的蛋黄蛋白（新鲜鸡蛋作为对照）。受精卵孵化12天后，5种蛋白质的相对含量显着增加，而15种蛋白质的相对含量显着下降，为研究特定卵子蛋白质在不同胚胎阶段的吸收动力学提供了线索。
研究人员通过基于凝胶的蛋白质组学分析，提供了整个胚胎发生阶段(第0、7、14和18天)蛋黄蛋白的全局视图。随着孵化第14 天蛋白质数量的显着变化，表明该时间点在胚胎发育过程中至关重要。此外，在第14 天，在胚胎中观察到卵清蛋白从蛋清加速转移到蛋黄中，这表明胚胎发生过程中存在未知的蛋白质吸收途径。2020年，相关研究分析了不同孵化天数（0、10和18）的蛋黄蛋白组成。在孵化的第10天，VTGs的相对较高的表达量表明它们在脂质的定位和运输以促进胚胎发育中的作用，而低表达的卵转铁蛋白可能参与胚胎软骨形成。为了更好地了解鸡蛋蛋白质的变化及其在孵化过程中的修饰，通过使用串联质量标签(TMT) 标记的定量技术进行了几项比较蛋白质组学研究。一项N-糖蛋白组研究表明，在孵化第12天，蛋清和蛋黄的蛋白质发生显着变化，主要涉及离子结合、细胞增殖、抗菌、细胞骨架和胚胎发育。同时，在相同条件下进行的另一项定量磷酸化蛋白质组学分析表明，差异化的磷酸化蛋白质与分子功能调节剂、转运蛋白活性和结合有关。作为鸡蛋的另一个重要组成部分，蛋壳提供了一些物理化学保护，防止病原体入侵。通过几种蛋白质组分析进行了胚胎发育过程中壳的生物活性蛋白的鉴定和预测。蛋白质类型及其分子功能在不同的潜伏期有所不同。在鸡蛋孵化期间对蛋壳膜蛋白进行的另一项定量蛋白质组学分析报告称，一组参与氧转运和钙结合的蛋白质仅在第8天和第18天之间存在。与此同时，研究人员通过定量蛋白质组学研究了蛋壳的矿化过程，并证实了重要蛋白质的存在，例如卵转铁蛋白、溶菌酶、卵磷脂116 和卵卵磷脂17。这些研究提供了对蛋壳蛋白功能和进化性质的全面理解。总体而言，在鸡蛋孵化过程中，各种蛋白质PTM和蛋白酶抑制剂平衡在通过改变二硫键的数量、蛋白质折叠、静电相互作用和疏水性来改变蛋白质结构特征方面发挥着关键作用，从而调节蛋白质表达，分泌、相互作用和激活，从蛋白质组学角度反映胚胎发生的潜在机制。
5.未来展望
所有与鸡蛋成分相关的条件都会导致鸡蛋蛋白质不同程度的降解、展开和聚集体的形成，这可能会影响鸡蛋蛋白质的营养和功能特性，以及鸡蛋蛋白质的消化率。除了鸡蛋蛋白在人体营养中发挥重要作用外，这些蛋白的结构可能会受到不同程度的咀嚼和胃肠道消化的影响，为消费者提供各种健康益处。通过多肽组学方法，一项研究报道了不同热处理对鸡蛋清蛋白体外消化的影响，热处理可能会改变一些具有抗菌、降压和抗氧化特性的独特多肽。由于缺乏评估鸡蛋蛋白在消化道中命运的研究，鸡蛋可能仍然包含一些未知的作用，值得进一步研究。蛋白质组学可能是全面揭示鸡蛋过敏原胃肠道消化过程中各种加工条件的影响和免疫反应性的有效工具。
此外，现有的鸡蛋蛋白质组学研究更多的是关于不同条件下食用前的鸡蛋基质，而食用后对人体的影响及其相互作用尚未完全阐明。仅仅有几项研究进行了体内试验，以测试膳食鸡蛋蛋白对肠道菌群(基因组学)的影响。蛋白质组学结合其他组学工具综合解析人体对鸡蛋的反应还需要进一步的研究，这将使我们了解鸡蛋的内在属性，从而设计出更好的食物。
6.结论
自20年前首次将蛋白质组学方法应用于鸡蛋蛋白质组分的研究以来，关于鸡蛋不同部位蛋白质组学的研究层出不穷。这些研究的目的大都停留在通过分离技术的不断改进以及多种分离、鉴定手段的结合，尽可能全面地鉴定鸡蛋中所有的蛋白组分。由此可见，鸡蛋蛋白质组学的研究在经历了方法的摸索阶段后，所鉴定的蛋白数量已经大幅增加，这为进一步分析这些蛋白质的生理功能及相互作用开辟了巨大的研究空间。鸡蛋蛋白质组学的特征主要有四个方面:（1）早期蛋白质组学研究的目的是通过分离技术的不断改进和各种鉴定方法的结合，尽可能全面地识别新的、整合的鸡蛋蛋白质信息，使之从未知走向已知。（2）基于鸡蛋蛋白质组数据，在不同条件下进行蛋白质组比较分析，以监测不同动态过程阶段的蛋白质属性，调整加工步骤，预测货架期，评估营养和功能价值。(3)近年来，多肽组学和翻译后修饰组学的蛋白质组学细分使鸡蛋科学进入了更详细的领域，进一步探索蛋白质的功能，为标志物检测、鸡蛋品质评价、遗传和生物学未知揭示、胚胎营养补充等领域提供了很大的机会。(4)生物信息学的革命也促进了鸡蛋蛋白质组学的发展，蛋白质组学作为大数据集的度量，可以综合数据提取信息。
总之，鸡蛋蛋白质组学通过将分子信息与表型属性(与鸡蛋成分、鉴定、蛋白质的生物活性和一般品质性状相关)联系起来，实现了对全部或动态蛋白质的大规模分析，尤其是对它们的位置、丰度和PTMs的分析。事实上，这种方法有助于研究鸡胚胎发育和家禽生产各方面的影响，这将有助于改善家禽管理和提高鸡蛋的质量。此外，这一有用的工具可能为食品工程中的蛋源蛋白/多肽以及理解鸡蛋与人体相互作用的影响提供未来的研究指导，使人们对鸡蛋的新功能及其加工技术有更深入的认识。
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