综述 |Front. Immunol.：通过蛋白质组学了解T细胞功能的新见解和挑战

 点击蓝字“蛋白质组”,轻松关注不迷路

生科云网址：https://www.bioincloud.tech/

---

编译：微科盟-云阳，编辑：微科盟Emma、江舜尧。

微科盟原创微文，欢迎转发转载。

导读

T细胞与同源抗原接触后会迅速从静态激活为增殖状态并发挥效应功能。这些过程由染色质重塑、基因转录和代谢相关的信号转导途径严格控制，共同驱动特异性T细胞的记忆或效应细胞的发育。任何一个过程的异常调节都可能引起疾病的发生，在过去几年中，一些新方法的出现已使我们可以在单细胞水平理解这些过程。随着单细胞基因组和转录组测序方法的大量出现，改变了我们对T细胞激活、发育潜力以及在正常和各种疾病状态下的效应功能的理解。虽然取得了许多进展，但对于其如何实现蛋白翻译的研究数据仍十分有限。例如，调节T细胞功能的蛋白质异构体/特异性的翻译后修饰仍未可知。蛋白质组学的应用可以改变这一状况，使人们能够深入了解T细胞功能的分子调节机制。然而，与基因组学方法可在mRNA和染色质水平上实现对T细胞动态变化的精确可视化不同，蛋白质组学方法（包括在单细胞水平上的方法）明显滞后。在这篇综述中，我们总结了近期的一些研究，使我们能够更好地理解蛋白质合成和降解在T细胞激活和效应功能获得过程中的变化，进而强调了技术的进步以及这些技术如何被应用于T细胞生物学研究中。最后，基于对T细胞蛋白质组和疾病的现有认知，探讨了在未来我们所需要拓宽的领域。

论文ID

原名：Emerging insights and challenges for understanding T cell function through the proteome译名：通过蛋白质组学了解T细胞功能的新见解和挑战
期刊：Frontiers in ImmunologyIF：8.786发表时间：2022.11通讯作者：Laura A. Solt通讯作者单位：美国佛罗里达大学斯克利普斯研究所

主要内容

1. 介绍
有效的免疫应答包括抗原特异性T细胞克隆增殖为效应细胞，这是适应性免疫的基础。这种应答过程需要多种信号通路的共同作用，激活代谢途径和转录因子，使细胞大小、增殖、分化等发生一系列巨大变化。活化的T细胞在1-2天内至少可以增加两倍，随后每6-12小时翻一倍。此外，面对不同的细胞环境，抗原特异性CD4⁺ T细胞可以分化为任何数量的辅助性T细胞（即T_H1、T_H2、T_H17等），而抗原特异性CD8⁺ T细胞也可发展成为“效应”和“记忆”群体，若发生持续性感染或被清除时，它们的寿命和效应功能会有所不同。基因组学和转录组学技术的进步极大地提高了我们对免疫应答过程中T细胞转录调控的认识，在某些情况下可达单细胞水平。虽然在这些方面显然还有待提高，但所有这些过程的核心都是蛋白合成。蛋白质是细胞的组成成分，是执行基因编码的基础。蛋白质的表达通常是由mRNA的表达推断而来，但其相关性并不一定准确，也不能解释翻译后修饰（post-translational modifications，PTM）、细胞定位、切割事件或各种亚型。因此，与基因组学和转录组学的最新进展相比，我们缺乏对T细胞免疫应答时的蛋白质组的了解。然而，蛋白质的结构、折叠或PTM状态的细微变化都可能对我们的健康产生重大影响，但这些变化可能在mRNA水平上无法观察到。因此，蛋白质可以是疾病的病因（即阿尔茨海默病）或治愈方法（即使用抗体作为治疗方法）。在这篇综述中，我们回顾了目前在T细胞蛋白研究中的方法技术、蛋白质组学的重要性，以及有利于更好了解T细胞激活和产生效应功能时蛋白质组学特征变化的最新研究。我们还讨论了蛋白质组学的技术进步，未来需要增加对T细胞蛋白质组的了解，使其成为T细胞生物学的主流分析方法。
2. 免疫学家目前检测蛋白质的工具箱
免疫学家利用多种技术来分析T细胞中的蛋白质，有些技术可以达到单细胞水平。蛋白图谱分析技术包括但不限于酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assays，ELISA）、免疫组化、蛋白免疫印迹法（western blotting）、基于流式细胞术的技术以及与测序相结合的转录组和抗原表位细胞索引（cellular indexing of transcriptomes and epitopes by sequencing，CITE-seq）。ELISA、免疫组织化学和蛋白免疫印迹法都是低通量技术，依赖于特异性抗体，但抗体价格昂贵且受限于其可检测的抗原数量。ELISA可以一次只检测一个因子，也可以检测多个（如Luminex技术），但这些检测可能成本高昂。几年前，单细胞蛋白免疫印迹法（Single-cell western blotting，scWesterns）被引入并应用，其可以在显微镜载玻片上观测细胞间的异质性。然而，该方法同样是低通量的且受限于目标蛋白的可用抗体数。一些基于流式细胞术的方法已经可以在单细胞水平上实现蛋白定量。传统的流式细胞术，也称为多色流式细胞术，依赖于一系列带通滤波器，可形成一个有利于分析特定荧光团的小型光谱窗口，基于这种方法最多可以定义30个子集。由于传统多色流式细胞仪的局限性，随着光谱流式细胞术的引入，最多可使得免疫细胞上40个参数被可视化。质谱流式细胞术（Cytometry time of flight，CyTOF）是流式细胞术的改进方法之一，其采用重金属离子标签代替荧光团标记抗体。CyTOF是一种强大的工具，最多可同时将60个单独的参数可视化来量化标记的目标，特别适用于样本量有限的免疫人群的深入分析，有效应用于HIV和癌症患者的T细胞衰亡状态的亚群多样化研究。CyTOF还与代谢测定相结合，用于阐明人类初始T细胞和记忆细胞毒性T细胞的代谢状态，以建立对T细胞功能状态的更可靠的理解。CyTOF以及其它基于流式细胞术的技术为正常和疾病状态下的T细胞生物学提供了重要的机制见解。然而，与前面介绍的技术一样，这些方法受限于目标蛋白质抗体的可及性和每个样本可以分析的参数的数量。CITE-seq是近期报道的一种在单细胞水平上可同时测量RNA和蛋白质转录本的方法。CITE-seq使用一组寡核苷酸标记抗体将蛋白质谱分析与单细胞液滴RNA测序相结合，以确认每个细胞的RNA水平和抗体数量（作为蛋白质水平的指标）。每个细胞可以使用多个抗体来获得表面蛋白质的定性和定量信息，该方法近期被用于免疫细胞中以描述与年龄相关的改变。基于该方法，该研究的作者发现了一个与年龄相关的CD8⁺ T细胞亚群，具有T细胞衰亡和组织归巢功能特征，表明这些细胞可能是年龄相关免疫功能障碍的潜在靶点。另一项研究将CITE-seq与TCR测序结合，以确定非小细胞癌症中CD4⁺和CD8⁺ T细胞的新抗原反应性T细胞特征。这种方法可以快速识别新抗原反应性TCR，并通过患者新抗原特异性T细胞的工程改造来优化个性化治疗。最后，有研究采用CyTOF、CITE-seq和scRNA-seq的组合来解决心血管疾病（cardiovascular disease，CVD）患者动脉粥样硬化斑块中的免疫多样性问题，该研究的作者发现了CD4⁺ T细胞亚群的显著差异，确定了被激活的T细胞亚群部分会发生分化，而另一部分会表达衰亡标志物。从这些技术中产生的数据将有利于设计更精确的CVD治疗方法。上述方法特别是在组合运用时十分有效，虽然它们明显比单独使用单细胞RNA-seq更具优势，但类似于基于流式细胞术的方法，CITE-seq受可用于细胞检测的标志物数量的限制。虽然这些方法被认为是考察T细胞功能性非常强大的系统，但无法全面概述细胞群体中的蛋白质表达或各种应激变化，需要应用其它方法来将其可视化。
3.蛋白质组
在生物系统的研究中，我们会运用基因组学、转录组学和蛋白质组学。蛋白质组学最基本的形式是研究蛋白质，特别是研究不同蛋白质之间如何相互作用。不同类型的蛋白质组学可以拓宽我们对细胞或靶组织内蛋白质组成的理解：表达蛋白质组学—样本间蛋白质的定量研究；功能蛋白质组学—评价蛋白质间的相互作用，阐明生物学功能；结构蛋白质组学—在全基因组范围内测定三维蛋白质结构；化学蛋白质组学—蛋白质-小分子相互作用的评估。虽然有多种技术可以测量细胞中蛋白质/蛋白质相互作用，但质谱（mass spectrometry，MS）是这些应用的核心。它是一种综合工具，不仅能够识别蛋白质，而且能够定量和定性地描述蛋白质的结构、异构体、翻译后修饰（post-translational modifications，PTMs）以及蛋白-蛋白相互作用，此外，质谱也是鉴定脂质和代谢物的有力工具。虽然所有的蛋白质组的类型和物种鉴定都值得深入讨论，但在这篇综述中，我们将重点讨论表达蛋白组学和蛋白质鉴定。质谱法主要使用两种工作流程方法来鉴定蛋白质：一种是自下而上法（bottom-up approach），也称鸟枪蛋白质组学法，另一种是自上而下法（top-down approach）。传统的自下而上蛋白质组学方法包括酶促胰蛋白酶将蛋白质消化为肽段，经高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）分离和离子化，通过串联质谱进行片段测序。蛋白质会被消化成长度为5-20个氨基酸的肽段。如果样品在离子化前已用化学试剂处理以分离化合物，则可以使用液相色谱-质谱（liquid chromatography-MS，LC-MS）。由于仪器的高性能、富集分析工具的改进、高分辨质谱的可及性以及数据采集方法的创新，自下而上蛋白质组学已经成为一种常规分析流程。然而，当蛋白质被消化成小肽，灵敏度可能会降低。例如，对单个蛋白质的PTM、截短、突变和多态性的映射能力受到肽分析的限制，经常出现gap和模糊的结果。使用搜索引擎（包括Mascot或Sequest）将肽质量与的已知数据库关联，如果数据库不完整或氨基酸具有相同的质量（即亮氨酸和异亮氨酸），则只有部分片段能被识别。自上而下蛋白质组学是一种描述和识别完整蛋白质的方法，既有其自身优势，也有其自身局限性。最大的优点在于其可以对完整蛋白及其修饰（包括PTM）进行定量。然而，由于仪器的限制，该方法的灵敏度比bottom-up MS低100倍，并且由于难以产生蛋白质的气相碎片，限制蛋白质大小平均为50kDa。此外，该方法还可能会遗漏一些低丰度的蛋白质，包括转录因子。但该技术具有映射蛋白质序列和定位每个蛋白质上的多个PTM的潜力，可全面概述细胞中的蛋白质。近期的蛋白质组学研究利用自下而上和自上而下的质谱法，为人类和小鼠的T细胞功能提供了前所未有的见解。
4.应用蛋白质组学研究T细胞功能
转录分析和下游信号网络分析有助于我们了解T细胞在免疫系统中的功能。然而，T细胞激活是动态的，会诱导一系列转录组学无法捕获的信号转导机制，包括快速蛋白质翻译、PTM和细胞代谢的变化，所有这些都是T细胞激活和功能发挥的关键。近期，基于串联质谱标签（tandem mass tag，TMT）等方法的质谱技术已经可以从多个样品或组织中鉴定和定量蛋白质。一个研究组尝试通使用抗CD3和抗CD28分别激活小鼠初始T细胞2、8和16小时来捕捉记录关键的T细胞激活反应过程，并对这些细胞进行全蛋白质组分析和磷酸蛋白质组分析。与他们最初的假设相同，TCR信号诱导的蛋白质组和转录组之间存在弱相关性，mRNA表达显著滞后于蛋白质表达。TCR信号具有不同的激活阶段，初始TCR激活会快速（2小时内）诱导磷酸化发生，总蛋白质丰度变化有限（早期）。在8-16 h时（晚期），大量蛋白质组和磷酸化蛋白质组发生重组，使蛋白质翻译和线粒体/代谢功能发生改变。综合分析方法可以预测初始T细胞从沉默状态变为激活状态，包括DNA损伤反应和MAPK信号通路的下调。该研究确定了参与T细胞激活的分子通路，对T细胞的维持和生存具有重要意义。更重要的是，如果没有整体蛋白质组学和磷酸化蛋白质组学分析，该T细胞回路将无法建立。PTMs在T细胞激活和下游反应的调控中具有重要作用，除磷酸化外，还有一些PTMs（包括泛素化）也可以影响T细胞的激活。在TCR-CD28结合后，泛素可以进一步调节蛋白质丰度和活性。由于泛素与赖氨酸残基以共价键相结合，通常与蛋白酶体或溶酶体降解有关，大多数报道将泛素介导的降解与T细胞的激活相关联。但越来越多的证据表明，泛素化所产生的非降解结果也可影响T细胞信号转导反应，包括PI3K的p85亚基的泛素化影响其对CD28和TCRζ的募集。因此，有研究人员对原代小鼠的CD4⁺ T细胞进行了蛋白质组学和转录组学的研究，考察泛素化降解与非降解的影响。他们在原代CD4⁺ T细胞中鉴定出5500种蛋白质，与Tan等人的发现相同，TCR诱导的转录组变化与蛋白质丰度相关性较差。为了探究泛素化的影响，他们设计了一种使用二甘氨酸残基的分析方法。当泛素与赖氨酸底物结合时，泛素内的裂解会产生二甘氨酸残基，可以被抗体富集并被质谱检测。基于该方法，鉴定出约1200个CD4⁺ T细胞的泛素化底物，有利于确定T细胞激活所引起的降解性和非降解性泛素化。目前，由泛素介导降解的蛋白质包括NFKB1、ZAP-70和LAT，虽发生泛素化但未产生降解的蛋白质包括CD3є、CD3γ、CDC42、RAC1、RHOA和GRAP。结合全细胞蛋白质组学、二甘氨酸残基分析和转录组学，该研究小组在沉默的和激活的CD4⁺ T细胞中建立了一个可预测泛素化引起的TCR刺激的方法。该研究为探究TCR依赖的非降解性泛素化过程及其对T细胞活化和功能的影响提供了重要的参考资源，若仅靠基因组和转录组技术则无法实现。转录因子的翻译后修饰在转录因子的功能中发挥着关键作用，然而对这些PTMs的鉴定极具挑战，蛋白质组学在识别关键的PTMs方面发挥了重要作用。对T_H17细胞的RORγt进行免疫沉淀及质谱分析后确定了两个关键的T_H17细胞发育磷酸化位点；一个对T_H17细胞的发育至关重要，而另一个则对其有抑制作用。另一项研究鉴定了RORγt上的一些乙酰化位点，这些位点可经Sirtuin 1（SIRT1）去乙酰化，从而提高自身免疫。定量磷酸化蛋白质组学已被用于表征T_H17细胞中IL-23信号传导，共鉴定168个磷酸化位点，IL-23信号会引起肌球蛋白调节轻链（pRLCS20）的磷酸化，而pRLCS20是肌动蛋白细胞骨架收缩和细胞迁移的关键调节因子，他们的研究揭示了IL-23在调节细胞运动中的关键作用。此外，还有研究小组运用具有高分辨率的磷酸化蛋白组质谱法鉴定细胞毒性CD8⁺ T细胞（CTLs）中IL-2介导的磷酸化反应。IL-2对于CD4⁺和CD8⁺ T细胞的克隆扩增至关重要，但在这项研究之前，缺乏对IL-2信号通路的全面了解。作者利用磷酸化蛋白质组学对IL-2调节的磷酸化蛋白质组进行了全面表征，揭示了CTL中SRC家族激酶控制的磷酸化网络和IL-2-JAK信号单独调控的磷酸化级联。具体而言，他们发现SRC激酶调节了CTL大部分的磷酸化蛋白质组，并使其有别于与其它IL-2-JAK1/3介导的反应。SRC激酶需要维持关键代谢激酶的活性，包括mTORC1和AKT，而IL-2-JAK信号协调转录因子、染色质调节因子、mRNA翻译、GTP酶等的磷酸化。这些数据反映了CTL中蛋白质磷酸化的复杂性，未来细胞磷酸化修饰动力学将研究信号通路的协调调控网络。最后，T调节细胞（T regulatory cells，Tregs）的Foxp3复合物纯化后经生化和质谱分析，结果显示Foxp3存在于400-800 kDa或更大的多蛋白异质复合物中。虽然发现了350多种相关蛋白，但大多与转录相关，包括Cbfb、Bcl11b、Ikzf3和Chd4。有趣的是，Foxp3能与许多作为自身辅因子的基因结合并调控这些基因，包括Runx、NFAT和GATA-3。GATA-3此前被认为可调控Treg的功能和稳态，通过质谱分析该调控作用并进一步鉴定了由Foxp3和GATA-3共同调节的对Treg细胞命运和功能重要的基因子集，包括Ets2、Satb1和Klf3。这些研究阐明了基于质谱的蛋白质组学如何识别关键的细胞调控过程，并有助于理解T细胞生物学。哺乳动物细胞（包括T细胞）中的蛋白质周转受到许多细胞过程的调节，哺乳动物靶向雷帕霉素复合物1（mammalian target of rapamycin complex 1，mTORC1）发挥着重要作用。由于尚未建立对其在T细胞蛋白质水平上功能的基本分子理解，有研究小组使用定量质谱法比较CD4⁺和CD8⁺ T细胞蛋白质组的抗原重组，以确定mTORC1的调控作用，最终共鉴定9000多种蛋白质，进而阐明了环境信号通路如何与抗原和细胞因子信号相结合，从而产生特异且适当的免疫应答。作者确定了CD4⁺和CD8⁺ T细胞之间的关键差异，其中，CD8⁺ T细胞的氨基酸转运蛋白SLC1A5相较于CD4⁺ T细胞增加了10倍，而且CD8⁺ T细胞还具有更多的蛋白质翻译机制和营养转运蛋白，这可能是其增殖能力增强的原因。虽然在CD4⁺和CD8⁺ T细胞之间没有观察到mTORC1的主要差异，但初始CD4⁺ T细胞对mTORC1具有独特的依赖性，特别是在细胞周期调节方面。为了更好地理解转录因子Myc如何通过TCR控制CD4⁺和CD8⁺ T细胞的活化和代谢，该研究组采用了类似的方法，结果表明Myc控制T细胞中的蛋白质组重组，调节T细胞生物能量和生物合成过程中关键的氨基酸转运蛋白，维持细胞正常生长发育。虽然发现T细胞在代谢过程中具有Myc依赖性和非Myc依赖性，但氨基酸转运蛋白的上调是维持T细胞中Myc表达的前馈回路的一部分，研究数据说明了Myc对特定的T细胞代谢功能（包括谷氨酰胺代谢和糖酵解）的重要性。为了进一步研究T细胞的代谢调节，在另一项研究中，该研究组通过高分辨率质谱分析CTL的蛋白质组来更好地了解CTL功能中的mTORC1和mTORC2活性。作者在CTL中发现了约6800个蛋白质，此外，CTL还具有高mTORC1活性且mTORC1比mTORC2更具有主导作用。尽管如此，但只有一小部分CTL蛋白质组受mTORC1的活性控制；mTORC1控制代谢、效应和粘附分子的表达。当比较CTL的转录组和蛋白质组时，他们发现mRNA和蛋白质丰度之间存在差异。例如，虽然CTL的T-bet和Eomesodermin（EOMES）的mRNA表达量相当，但T-bet蛋白的表达量显著高于EOMES。IL2-受体的mRNA和蛋白表达也存在明显的不一致。mRNA表明受体链的化学计量比为3:1:2（α:β:γ），而蛋白质的相应比例分别为92:1:2。此外，这项研究使用mTORC1和mTORC2抑制剂，证明了无偏蛋白质组学可帮助理解药物在细胞中的作用。总之，上述研究强调了蛋白质含量的定量非靶向分析在理解T细胞功能和代谢调节方面的作用。与小鼠的研究相比，人类T细胞蛋白质组学的研究更令人困惑。如其蛋白质组学和转录组学数据之间有很强的相关性，这由细胞类型和取样时间点决定。一研究组将蛋白质组学和转录组学相结合来研究细胞因子对人类初始（T_N）和记忆（T_M）CD4⁺ T细胞免疫应答的影响，以更好地理解记忆细胞中的细胞因子效应，此前尚未对其进行深入研究。T_N和T_M细胞分化为四种不同的辅助性CD4⁺ T细胞亚型（T_H1、T_H2、T_H17和iTreg），在激活后16小时和5天收集，并进行蛋白质组学和转录组学分析。与小鼠研究相似，作者发现蛋白质组和转录组在T细胞激活初期时存在差异。然而，在初始激活的下游，RNA和蛋白质的表达在所有被评估的群体中都具有高度相关性。一个令人惊奇的发现是，尽管T_N可以分化为任何辅助性T细胞群体，但T_M细胞不具有T_H2表型。有趣的是，T_M在对iTreg信号应答时，可能由于对TGFβ信号的依赖而获得了T_H17表型。当与转录组学结合使用时，蛋白质组学揭示了T细胞从初始到记忆存储再到效应记忆T细胞表型的变化过程，发展过程伴随着效应分子表达量的增加，从而增强了对环境刺激和细胞因子信号的应答。在另一项研究中，对人类T_H17细胞中蛋白质组与转录组的评估也揭示了数据集之间的高度相关性。然而，与相应的已发表的小鼠数据集相比，作者发现人类和小鼠的T_H17细胞蛋白质表达几乎没有重叠。这可能是由于作者只将人类的T_H17数据与一只小鼠的数据时间点进行了比较，此外，激活条件也可能影响整个蛋白质组。Revu等人最近的一篇论文证明，体外培养人类T_H17细胞不需要抗CD28信号。相反，IL-23信号作为第二信号是足够的，而且在体外分化条件下这些细胞相比传统的人T_H17细胞可产生更稳定数量的IL-17A，其量与小鼠T_H17细胞更一致。在这项特殊的研究中，尚不清楚IL-17A在人类T_H17细胞中的表达与在小鼠T_H17细胞中~45%的表达相比有多大程度的差异。此外，作者在人类T_H17细胞的蛋白质组学数据中发现，包括IL-17A、IL-17F和RORγt在内的关键T_H17蛋白几乎没有上调，这表明分化过程可能并不理想。尽管在小鼠和人类样本之间进行平行研究对其翻译过程的了解很重要，但在比较数据集时，尤其是在两个物种之间，在解释数据时应谨慎。细胞类型不仅应得到验证，其激活和分化状态还应具有可比性，以便进行公平和准确的比较。其它明确的例子也证明了蛋白质组和转录组数据集之间的差异，这确切证明了独特的T细胞子集和特征。如一项研究探讨了人类Foxp3⁺ T调节（Tregs）细胞如何抵抗T效应器或常规细胞的获取。作者将蛋白质组学和转录组学相结合用于人类血液来源的初始CD4⁺ T细胞和效应Tregs（effector Tregs，eTregs）研究，并鉴定了人类血液中功能不同的Foxp3⁺ CD4⁺T细胞，定义了一种常见的Treg特征以及eTregs的特异性。这些特征包括参与多种细胞功能的蛋白质，常见的Treg特征包括Foxp3、Helios、代谢蛋白（GK、SHMT2）、铁储存蛋白和溶酶体蛋白。eTreg特征包括蛋白质参与的细胞凋亡、有丝分裂、DNA复制等。与小鼠样本的描述相似，Treg的蛋白质组特征与转录组几乎没有重叠。作者推测这种差异可能与Tregs的细胞状态（即稳定状态与激活状态）相关，因为mRNA的稳定性可能存在争议。这些差异在需要蛋白质合成的循环细胞中可能不太明显，但无论如何，仅基于转录组学是无法预测Treg的特征。总之，这些研究表明T细胞中的蛋白质组数据还需仔细分析和解释，并考虑细胞状态/将此方法与转录组数据相结合，以生成T细胞的完整视图。
5. 蛋白质组学的挑战和未来展望：单细胞质谱和其它
虽然蛋白质组学是一个强大的系统，但它也面临着挑战，使其无法成为主流应用。与基于基因组学和转录组学的方法不同，蛋白质组学的处理量并没有那么高。此外，基因组学和转录组学工作的核心基础设施远比蛋白质组学更先进。例如，与蛋白质组学相关的样品处理、仪器和分离的方法技术并不像基因组学那样完善。数据分析在技术上也有很高的要求，需要一定的专业知识水平，而这仅见于一些常规进行蛋白质组学研究的学术实验室。因此，非常有必要开发数据分析管道，以规避这个问题，也许可以将目前应用于转录组学的管道改造后应用于蛋白质组学。除了这些限制之外，还有一些基本问题也阻碍了蛋白质组学成为主流应用。例如，与RNA和DNA不同，蛋白质不能被扩增，因此低丰度蛋白质（包括转录因子）经常被遗漏。而另一个挑战是数据稀少，理论上，所有肽类都应该可被质谱仪“读取”，然而，现实情况是蛋白质组的完整覆盖率并不高。样本量也是蛋白质组学成为主流的一个障碍。单细胞RNA测序（single-cell RNA-sequencing，scRNA-seq）、染色质转座酶可及性测序（Assay for Transposase-Accessible Chromatin-seq，ATAC-seq）和CUT&RUN的出现能够基于少量细胞来解决生物学问题。这些测定所需细胞数少，并且在探究某些细胞类型如何引起疾病发生时特别有用。然而，目前蛋白质组学所需的细胞数量远远超过了scRNA-seq等检测方法，限制了我们对小鼠疾病模型对体外分离的T细胞的研究能力。最后，虽然磷酸化蛋白组学的方法有了显著的进步，但SUMO化和糖基化等多种类型的PTMs都可调节细胞功能。因而，为了更好地理解细胞中的分子信号，需要对PTMs的亚细胞定位进行更深层次的理解，直到细胞器水平。虽然已经开发了几种方法来尝试实现这一点，包括APEX/APEX2和BioID/TurboID等酶接近标记法，但它们也有需要注意的地方。APEX利用过氧化氢会影响细胞代谢，从而影响PTM状态。TurboID和类似方法会普遍受到内源性蛋白质生物素化的影响，不仅会导致细胞中PTM的过度估算，还可能导致细胞毒性并干扰正常细胞反应。最近，基于生物正交邻近标记的亚细胞磷酸化蛋白质组捕获技术（SubMAPP）的进展可能有助于解决这些杂交和毒性问题。然而，很明显，无论是在整体还是在细胞器水平，我们都需要用更完善的方法来研究PTM以更好地了解其对T细胞功能的影响。虽然测量蛋白质丰度的变化对于理解细胞命运至关重要，但蛋白质结构重塑也同样重要。目前有几种方法可以在原子水平上测量蛋白质结构，但很少有方法可以直接观察功能细胞中的蛋白质结构。AlphaFold是一种人工智能（artificial intelligence，AI）系统，可以根据蛋白质的一维氨基酸序列预测蛋白质的三维结构，极大地提高了我们对静态蛋白质结构的理解。然而，该软件仍有一些局限性（即无法准确解析无序的蛋白质区域），所提出的结构需进一步验证，因为蛋白质不是静止的而是始终处于运动状态。不过，该软件可以预测生物学见解和燃料假说，从而推动对活细胞中蛋白质功能和相互作用的研究，并可以进行实验检测。在AlphaFold前使用一些方法能够观察结构变化，如有限蛋白水解质谱技术（limited proteolysis coupled to mass-spectrometry，LiP-MS），可在蛋白质组范围内识别其生物背景中的蛋白质结构变化。这种方法的设想是蛋白质结构中的残基可以被PTM、其它相互作用的分子或蛋白质的其他部分保护而不被蛋白水解消化。利用定时蛋白水解消化产生反映蛋白质/结构可及性的肽，配合质谱分析，可以预测复杂生物环境中的蛋白质结构。这些方法可能用于补充蛋白质丰度数值，以便最大限度地检测细胞生物状态的变化。无论如何，方法敏感性和数据分析管道的进步，是推进结构蛋白质组学和揭示功能性的重要见解所必需的，类似于为基因组学的研究开发的深度机器学习算法，有助于揭示来自质谱仪的肽/肽碎片数据中的“隐藏”信息。虽然还处于起步阶段，但目前仪器和方法的进步已可以基于质谱在单个细胞中检测脂质、蛋白质和小分子（表1；图1）。微流控芯片系统的运用加速了这一进程，使反应可在小体积内发生。ProteoCHIP和基于芯片的纳升级微量液滴蛋白处理系统（nanodroplet processing in one pot for trace samples，nanoPOTS）就是两种这样的设计。例如，nanoPOTS使用基于芯片的纳米液滴处理平台来增强小细胞群的蛋白质组学处理和样本分析。nanoPOTS减少了处理体积（< 200 nL，低于数百微升），同时保持了被认为是最佳批量蛋白质组样品制备所必需的参数。减少处理样品的体积可最大限度地减少样品的吸收损失，这是以前样品制备时主要的瓶颈问题。该研究小组使用nanoPOTS后能够从大约10-100个细胞或临床样本中实现3000多个蛋白质的可重复覆盖。具体地说，他们能够从一名1型糖尿病患者和一名健康者中通过激光显微切割分离出单个人胰岛横截面，并鉴定约2400种蛋白质。作者表示，他们的平台可以通过流式细胞术与细胞分选相连接，这对于想要进行类似实验的免疫学家来说是一个理想工作流。在这个平台基础上进行优化，另一个小组开发了一种“一体式”蛋白质组学样品制备和单细胞蛋白质组学数据采集方法，称为SciProChIP-DIA。该方法在单个设备中对样本进行多路复用，自动化细胞分离、制备、细胞计数、成像和样本处理，并结合数据独立采集质谱方法。本质上，他们为低输入样本开发了一个完全自动化的工作流程，最大限度地减少了样本损失，同时实现了较高的重现性和灵敏度。通过该自动化方法，研究人员在每个细胞中能够表征近1500种蛋白质，在人类腺癌细胞（PC-9）和慢性B细胞白血病细胞（MEC-1）中的错误发现率均为1%。与其它使用单细胞蛋白质组分析的研究相比（包括nanoPOTS），SciProChIP-DIA具有更灵敏的覆盖范围。作者假设SciProChIP-DIA是通用且可扩展的，可以适应各种应用，包括细胞刺激后动态蛋白质组变化的研究。表1 近期单细胞蛋白质组学相关研究
图1 单细胞质谱工作流程的基本概述单细胞蛋白质组学倾向于使用“自下而上”的方法。（1）单细胞分选置于多孔板上（每孔含一个细胞），裂解并通过胰蛋白酶消化。每个孔中的肽用条形码或标签标记，从而确定每个细胞中特定蛋白的含量。串联质谱标签（TMT）是一种常用的标签，在单个混合物中最多可区分18个样本。（2）TMT要求样本单独标记，然后混合用于多通道检测。（3）将混合样品注入LC-MS。（4）每一种肽会被离子化、分离和碎片化。（5）对肽段和条形码的分析可以分别在单细胞水平上进行肽段测序和蛋白质定量。（6）获得单细胞蛋白表达图谱。使用BioRender成像。
Mann实验室的最新进展打破了单细胞质谱分析的界限，在其最新的文章中，强调了一种叫做“深度视觉蛋白质组学”（Deep Visual Proteomics，DVP）的新技术。该方法将成像技术与无偏倚蛋白质组学相结合，对细胞中表达的蛋白质进行定量，绘制组织或细胞类型特异性蛋白质组，或识别细胞中的药物靶点。使用这种方法，他们通过自动化单细胞激光显微切割结合超高灵敏度质谱仪，发现了黑色素瘤进展中的细胞表型和失调通路。该系统适用于任何可以成像的生物系统，并且与最近报道的另一个应用程序FUNpro类似。FUNpro还使用一种基于显微镜的SCOPE-MS的方法，对单细胞蛋白质组进行功能性分析，可将蛋白质组与细胞表型联系起来。这两种方法都可以识别和表征罕见的细胞状态和相互作用。Mann实验室最近还开发了一种工作流，可以提高单细胞蛋白质组学的灵敏度。利用FACS分离细胞并将单个细胞逐个注入质谱中，他们称其为真正的单细胞衍生蛋白质组学（true single-cell-derived proteomics，T-SCP）。在使用他们改进的自动化工作流程后显示出高于以前的方法两个数量级的灵敏度，并能够分析癌细胞（HeLa细胞）中停滞的细胞周期状态。这些工作虽然提高了scMS的灵敏度，但不幸的是，大多数这些研究都是使用细胞系或从固定组织中分离的细胞进行的。未来需要从新鲜分离的离体样品（即小鼠或PBMC）中提取原代细胞（包括T细胞）进行单细胞蛋白质组学研究，以生成最稳健的体内蛋白质组学可视化景观。考虑到两种方法间的灵敏度，单细胞蛋白质组学倾向于使用“自下而上”的方法来识别蛋白质，而不是寻找完整的蛋白质（图1）。因此，改进的关键挑战与上述相似，包括分析物的覆盖率和表征深度。无论如何，在过去的5年中，单细胞质谱有了飞速的进步。照此下去，我们可以设想在更常规的方法上使用这一技术来解决问题，以更好地理解肿瘤中的T细胞异质性和衰竭，进而确定免疫肿瘤学的新治疗方法。单细胞质谱也可用于了解自身反应性T细胞中蛋白质水平失调机制，而这仅靠转录组学则难以探究。与癌症治疗一样，这些信息可能会为各种自身免疫性疾病带来潜在的新的治疗选择。因此，无论是整体还是单细胞水平的蛋白质组学，都是表征正常与异常激活T细胞的分子特征的必要手段，然而目前缺乏的相关信息，需要我们对生物学和疾病机制进行更深入的理解。原文链接：  https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fimmu.2022.1028366/full

----------微科盟更多推荐---------- 

      

如果需要原文pdf，请扫描文末二维码领取

请关注下方公众号

了解更多蛋白质组知识