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导读
高密度脂蛋白（HDL）的成分及其功能性之间的关系尚未完全研究，饮食对HDL蛋白质组的影响也知之甚少。因此，本研究致力于阐明与餐后高脂血症相关的HDL蛋白质组。实验中，健康男性志愿者接受了高脂肪酸的膳食干预，并在摄入前（基线）、进餐后2–3小时（餐后峰值）和5–6小时（峰值后）后采集血样。纯化后的血浆HDL样品通过液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）确定蛋白质组成。团队通过线性模型、方差分析和不同条件的多点测试进行数据处理，并使用R语言编程对每个蛋白质的表达谱进行聚类分析。本实验鉴定了320种蛋白质，筛选后保留了119种。实验结果表明，在HDL蛋白质组中鉴定的蛋白质（APOM、APOE、APOB和APOA2）是餐后高脂血症中仅有的具有显著表达量变化的四种蛋白（p值<0.05，logFC>1）。总之，我们已经可以描述整个HDL蛋白质组在餐后高脂代谢过程中的几种变化情况。
论文ID
原名：Proteomic analysis
of postprandial high-density lipoproteins in healthy subjects译名：健康人群餐后高密度脂蛋白的蛋白质组学分析期刊：International Journal of Biological MacromoleculesIF：8.025发表时间：2022.11通讯作者：Sergio
Montserrat-de la Paz通讯作者单位：西班牙塞维利亚大学
实验设计
实验结果
HDL是一组复杂多样的血液循环生物分子，其初始结构呈盘状，脂质比例较低，随着胆固醇酯（CE）在其内部聚集而成熟为球形。HDL颗粒的内部为脂质，主要是CE和甘油三酯（TAG）；外层由磷脂和蛋白质（主要是APOA1和APOA2）组成。然而，HDL颗粒是一类大小、形状和密度各异的蛋白质-脂质复合物，它们可以携带数百种不同的蛋白质和脂质，其成分差异很大。HDL成分的异质性影响其生物学功能。多项研究表明，HDL颗粒的功能状态受其蛋白质组成的影响。因此，我们需要更好地理解这种关系极其治疗学意义。因此，本研究致力于阐明餐后高血脂相关的HDL蛋白质组。目前，我们的研究已经能够识别277种蛋白质；过滤掉不相关的蛋白质后仍有119种。其中，四种蛋白质能够在统计学上显示出显著的表达变化：APOB表达在餐后高峰期间发生变化；APOA2、APOM和APOE在峰值后发生变化。最后，我们已经能够描述整个HDL蛋白质组在餐后高脂血症状态下的几种模式变化，其中一些与免疫系统调节和生物分子运输有关。
1. 蛋白质样品鉴定
最初，我们鉴定到277种蛋白质，但在数据预处理后，蛋白总数降至119。一方面，定量值低于70%的蛋白质被过滤掉；另一方面，被标志为潜在污染物的蛋白质也被排除在外。标准化使得所有蛋白质的表达量都遵循正态分布。图1显示，所有数据按受试者分组，与数据预处理和采样时间没有明显的关联性。
图1 蛋白组学样品的主成分分析（PCA）A显示了原始数据的PCA，图B显示了数据集经过预处理、标准化和填充后的PCA。红色圆圈表示表示39号受试者的样本，蓝色圆圈表示36号受试对象的样本。每个时间点用彩色圆点表示：绿色表示基线（0小时，B），红色表示餐后峰值（3小时，P），淡紫色表示峰值后（6小时，PP）。
2. 差异表达分析
一方面，基于MetaboAnalyst软件的多样本t检验和ANOVA的结果显示，没有蛋白质具有显著的差异表达。尽管尝试了不同的倍数变化（FC）及p值的阈值，从更严格的（FC＞2，校正p值＜0.01）到更宽松的参数条件（FC＞1.5，未校正p值＜0.05），我们都没有检测到任何具有显著性的蛋白。另一方面，在较为宽松的阈值条件（logFC>1和未校正p值<0.05）下，amica软件得到的回归模型显示出四种显著差异表达的蛋白质（APOB、APOM、APOE和APOA2）；然而校正p值没有产生显著结果。这四种蛋白都是HDL微粒中经常能够识别的蛋白质，许多其他研究都已经报道了它们的存在。首先，与峰值后的时间点相比，APOB在基础时间点的水平显著较低（图2）；APOM、APOE和APOA2的丰度在餐后峰值而非峰值期后有所上升（图3）。在基线和餐后峰值之间的对比中，HDL蛋白质组没有明显变化。
图2 以Log2FC（B/PP）和-Log10（p值）绘制的火山图（基线vs峰值后）橙色点是具有显著差异表达的蛋白质（未校正p值＜0.05，log2FC＞1）；而绿色点代表不具有显著性差异的蛋白质。
图3 以Log2FC（P/PP）和-Log10（p值）绘制的火山图（餐后峰值vs峰值后）橙色点是具有显著差异表达的蛋白质（未校正p值＜0.05，log2FC＞1）；而绿色点代表不具有显著性差异的蛋白质。
事实上，这些在特定时间点的结果与餐后脂蛋白代谢的整体特征基本吻合。APOB与乳糜微粒及极低/低密度脂蛋白（VLDL/LDL）相关；换言之，富含APOB的脂蛋白微粒的胆固醇和TAG的比例较高。当人体摄入大量脂肪后，由于小肠上皮细胞的吸收作用，血液中的TAG水平显著增高，这些TAG分子被运送到富含APOB的脂蛋白中。这些过程激活了脂质从肠道到肝脏的运输、再合成及分泌。此外，餐后APOB的水平较高，可以解释为富含APOB的脂蛋白和HDL微粒之间更为频繁的相互作用，从而促进脂质由HDL运送至肝脏。在血脂较高的状态下，这一过程对维持TAG水平的稳定至关重要。这些相互作用也可能由HDL的抗氧化作用所驱动，这个问题将在稍后进一步讨论。关于富含APOB的脂蛋白水平影响相关脂质循环这一话题，多位学者建议使用APOB水平而非HDL/LDL比值作为判定心血管风险和评估脂质代谢状态的指标。考虑到一项类似的饮食干预研究没有发现APOB水平的差异；因此上述结果只是初步的，需要在更大的人群样本中得到验证。虽然APOB在餐后高脂血症中起着重要作用，但我们也不能忽视APOA2、APOM和APOE；它们都会影响和调节脂质代谢。同时，它们在餐后峰值期间处于较高水平，以增强脂质代谢。这些载体蛋白以不同的方式调节脂质代谢。例如，APOA2可以帮助稳定HDL结构，因为它比APOA1亲脂性更强。当富含APOB的脂蛋白和巨噬细胞间频繁重塑时，APOA2水平的增加有助于稳定HDL微粒。此外，APOA2水平会根据胆固醇反向转运能力的需要而调节，使其在HDL中的含量在需要回收胆固醇的时间上调。至于HDL与富含APOB的脂蛋白和巨噬细胞相互作用的增加，APOM很可能在调节炎症和氧化方面发挥重要作用。APOM作为1-磷酸鞘氨醇（S1P）的主要载体，具有调节炎症、免疫系统、抗氧化能力、宿主防御及稳态的多重功效。事实上，在餐后时期，APOM可以增加HDL的抗炎特性。此外，APOM在HDL和LDL之间的交换是降低氧化LDL水平的重要机制，主要因为S1P在APOM-LDL中的亲和力更高。此外，研究表明，APOA1水平的增加会延长HDL阻止LDL氧化的时间；这与APOM水平的增加相吻合，很可能说明两者都具有降低LDL氧化的作用。最后，APOE在脂质代谢中具有关键活性。它取代了肝脂肪酶，是一种从细胞表面水解脂蛋白TAG所需的酶。此外，它还是LDL受体的主要配体。APOE在餐后峰值后降低是众所周知的现象；事实上，其调节富含APOB脂蛋白清除的能力是导致APOE在餐后状态下含量降低的部分原因。此外，APOE还能影响HDL的大小，使这些微粒的变大，并储存更多的TAG和胆固醇。总之，APOE似乎在脂质代谢中起着不可替代的作用，在高血脂状态下加强了它们的关联性。简而言之，所有涉及的蛋白质在高血脂的状态下都有表达量的改变，因为它们都以一种或另一种方式参与脂质代谢。
3. 功能性富集分析及APOB、APOM、APOA2和APOE在脂质代谢中的作用
我们对鉴定到的蛋白质组进行了功能性富集分析，以检查APOB、APOM、APOA2和APOE是否是HDL相关蛋白以及它们在脂质代谢中的相关性。基因本体（GO）分析中的“细胞成分”条目（图4A）验证了所有主要蛋白质均属于脂蛋白微粒。而且，所有这些蛋白都被记录为在HDL相关研究中多次识别；进一步佐证了这些蛋白是HDL相关蛋白的假设。从“分子功能”条目（图4B）中，我们可以得出结论，这些蛋白主要涉及脂蛋白重塑和代谢调节，如脂质转运活性、脂蛋白受体结合和脂质转移活性。这表明，它们在餐后反应中的作用主要集中在脂质转运和稳定HDL微粒，目的是有效清除循环中的TAG。此外，它们参与的大多数生物学过程和脂质稳态、HDL结构及其代谢的调节有关（图4C）。GO分析还发现，大多数富集通路与脂蛋白重塑和组装有关（图4D），再次证明了它们在餐后调节中稳定HDL微粒的作用。不同于预期的是，这些蛋白都与非脂质代谢通路有关，即感官感知和视觉光传递。总之，GO分析表明APOB、APOM、APOE和APOA2在餐后反应中的作用，主要因为它们调节HDL重塑和增强脂质运输的能力。
图4 GO功能性富集分析A、 B和C属于GO中的每个数据库（CC代表细胞成分，MF代表分子功能，BP代表生物过程），而D是来自KEGG和REACTOME数据库的通路术语。它们首先按每个术语中涉及的基因数量排序，然后按调整后的p值排序，此图仅显示了该排序方法的前20个术语。红色条状代表了超过一半的基因所涉及的术语。
4. 共表达聚类分析显示调节非脂质代谢功能的蛋白质的相关表达模式
我们还对预处理的数据集进行了共表达模式的聚类分析，旨在确定蛋白质之间的相似行为。我们实现了将所有蛋白质分类为8个簇（图5）；然而，簇4、簇6和簇8被发现与HDL完全无关。通过关注相关的蛋白簇，我们发现了三种模式（图6）：在整个时间段中，表达增加、减少或没有变化。随时间变化蛋白表达量增加的簇是簇1和簇3，其中簇1包含APOB。簇5中的蛋白质在整个过程中没有明显变化；因此在这一组中，我们可以发现所有HDL蛋白都不受高血脂的影响。最后，簇2和簇7蛋白随时间变化表达量降低。从现在起，我们将这两簇定义为簇D，以将差异表达分析中的所有重要蛋白（APOE、APOA2和APOM）保留在同一簇中。至于每个簇内蛋白的功能特征，簇1似乎只包含与激活级联途径和免疫系统相关的蛋白质，该簇中超过一半的蛋白质参与这些途径（图7A）。同样，簇3具有混合功能：该簇中最高比例的通路为止血和血小板能力调节，另有小部分蛋白涉及免疫系统和补体级联途径调节。有趣的是，簇3主要与簇D（2+7）具有相似的功能，也与簇1有一定的相似性。簇D和簇3蛋白都参与止血和血小板调节（图7B中的红框），但它们具有相反的表达模式。这一现象表明，这两个簇的蛋白质可能通过协同作用，调节血小板止血。然而，D簇中的蛋白质也可能与HDL重塑有关。事实上，APOE、APOM和APOA2属于这个簇，所以这个簇的蛋白质可能负责脂质代谢本身的调节。
图5 每个簇的方框图表示每个样本中所有蛋白质表达谱的总和数字表示采样时间点：基线（0小时）、餐后峰值（3小时）和峰值后（6小时）。
图6 按时间点汇总的蛋白簇的方框图数字表示采样时间点：基线（0小时）、餐后峰值（3小时）和峰值后（6小时）。
图7 蛋白簇1、3、5和D（即2+7）的REACTOME通路富集分析X轴表示属于每个通路的相关基因的比例，红色条状表示超过一半的基因与该通路相关。绿色框表示蛋白簇之间共有的通路，红色框仅表示簇3和D之间共享的通路。
簇1和簇3之间共享的通路为与补体和凝血级联调节相关的功能，它们都沿着时间而表达上调。然而，补体级联调节似乎受到所有相关簇中蛋白质的影响。这表明该通路与餐后反应有关，通过簇D中的蛋白抑制其作用，同时通过簇1和簇3中的蛋白激活其他一些作用（图7中的绿框）。最后，簇5（丰度无变化）的蛋白参与多种通路，主要是通过补体级联调节免疫系统和血小板调节止血，其他簇的蛋白也调节这些通路。这两种通路的激活或失活情况尚不清楚，需要进一步实验来验证。
5.蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络分析
从PPI分析的结果来看，APOB、APOM、APOE和APOA2是公认的相互作用蛋白，他们创建了一个非随机网络且具有高置信度（置信度>0.9）。这些发现进一步支持了先前的假设，这四种蛋白质很可能通过协同作用调节餐后高血脂反应。另一方面，不同共表达簇的PPI网络产生了类似的结果。在簇1网络中，几乎所有蛋白之间都存在已知的相互作用。在簇3网络中，似乎有两组蛋白质相互关联，最大的蛋白组可能与止血相关；其中包括参与该途径的几种蛋白质，如丝氨酸蛋白酶抑制剂（SERPIN）G1、F2和C1。簇D的PPI网络与簇1相似，这一网络中大多数已知的PPI由脂蛋白参与且是唯一直接关注脂蛋白重塑和脂质代谢的集群。最后，关于簇5网络，该蛋白簇在过程中丰度无变化。这里，有四组蛋白通过APOA4、C8A和PLG产生关联。大多数蛋白质通过补体级联通路，参与免疫系统的调节，这与蛋白网络中大量的补体级联蛋白吻合（图8，蓝色）。事实上，红色和橙色的蛋白组与血小板活性有关；前者调节不同的血浆环境，而后者调节细胞骨架结合活性（图8，红色和橙色）。令人惊讶的是，有一些HDL相关蛋白聚集在一起，但尚不清楚它们是如何与止血蛋白组相关联的（图8，绿色）。总之，在我们的结果中，几乎所有蛋白质在差异表达分析和聚类分析中，都表现出了相互关联效应，这为我们的结论增加了可靠性。
图8 聚类D的PPI网络（STRING v11.5）该网络表示蛋白之间的相互作用，边缘的厚度表示该关联的数据可信度。
结论
我们的研究结果显示，HDL蛋白质组受餐后高血脂的影响。在餐后的特定时间点，脂代谢和脂蛋白重塑相关蛋白（APOB、APOM、APOE和APOA2）表达量上升。此外，蛋白质组的表达模式表明，脂肪酸还可以通过HDL调节其他生理功能，如免疫系统反应。
原文链接： https://doi.org/10.1016/j.ijbiomac.2022.11.187