科研 |中南大学湘雅医院：NO介导的蛋白质S-亚硝基化在透镜诱导近视中的作用机制（国人佳作）

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编译：微科盟-草重木雪，编辑：微科盟Emma、江舜尧。

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导读

近视是一种慢性眼病，是最常见的屈光不正类型。利用小鼠透镜诱导近视（LIM）动物模型，本研究旨在通过检测神经元一氧化氮合酶（nNOS）的表达及其下游的S-亚硝基化，初步探讨一氧化氮（NO）蛋白S-亚硝基化在近视调节中的作用。我们将3周龄C57BL/6J小鼠分为三组：I组，透镜诱导0周组（3周龄取眼球）；II组：实验组自我对照眼睛（7周龄取眼球）；III组为透镜诱导4周组（7周龄取眼球）。在模型建立前后，我们通过条纹视网膜镜和光学相干断层扫描（OCT）测量各组的屈光度和轴向长度；通过蛋白质印迹和免疫荧光染色测定nNOS和S-亚硝基化蛋白（PSNOs）的蛋白表达和位点。我们使用蛋白质S-硝基化的位点特异性蛋白质组学检测近视和非近视小鼠视网膜中S-亚硝基化蛋白的存在和位置；进行了基因本体论（GO）、京都基因和基因组百科全书（KEGG）和motif富集分析；通过GO、KEGG和motif分析差异位点。我们采用不可逆生物素化程序结合蛋白质纯化和蛋白质印迹检测缺氧相关信号通路中的关键角色α-烯醇化酶（ENO1）的蛋白质表达。模型组视网膜中nNOS和PSNO的表达显著低于对照眼和3周龄基线组。在近视眼和对照眼的视网膜中，我们通过位点特异性S-亚硝基化蛋白质组学鉴定，共有595个S-亚硝基化蛋白、709个S-亚硝基化肽和708个S-亚硝基化位点。我们共筛选了19个差异位点，其中与对照组相比，实验模型眼中13个位点下调，6个位点上调。具体而言，SNO-ENO1在实验眼视网膜中的表达显著低于对照眼和3周龄基线组。LIM诱导近视小鼠视网膜nNOS和PSNO蛋白水平降低。NO介导的非经典蛋白S-亚硝基化修饰可能在透镜诱导近视的调节中发挥重要作用。ENO1可能是近视眼S-亚硝基化修饰调节的关键因素。

论文ID

原名：Mechanisms of NO-Mediated Protein S-Nitrosylation in the Lens-Induced Myopia译名：NO介导的蛋白质S-亚硝基化在透镜诱导近视中的作用机制
期刊：Oxidative Medicine and Cellular LongevityIF：7.310发表时间：2022.11通讯作者：文丹通讯作者单位：中南大学湘雅医院眼科中心

实验设计

实验结果

1. 透镜诱发近视的确认

基线时，实验前各组的屈光度和轴向长度无显著差异（P>0:05）。此外，同一动物的两只眼睛之间的屈光度或轴向长度没有显著差异（P>0:05）。离焦28天后，I组、II组和III组的屈光度分别为+11:633±2:385 D、9:520±3:351 D和− 0:080±1:998 D（表1，图1（a））。离焦28天后，I组、II组、III组轴向长分别为3:397±0:034 mm、3:415±0:052 mm、3:490±0:048 mm（表1，图1（b））。

表1 建模后4周的屈光度和轴向长度（x±s）
图1 LIM 4周后屈光度和轴向长度的比较（a）折射比较。（b）轴向长度比较（P＜0:001，**P＜0:01，*P＜0:05）。

2. LIM组视网膜nNOS和PSNO蛋白表达降低

我们检测了I、II和III组视网膜组织中nNOS的表达。与I组和II组相比，III组的nNOS丰度明显减少（图2（a）和2（b））。我们进一步发现，第III组中PSNO的总表达水平也显著低于第I组和第II组（图2（c）和2（d））。免疫荧光显示，nNOS和PSNOs在神经节细胞层（GCL）、内丛状层（IPL）和外丛状层中表达较高，但在内核层（INL）和外核层（ONL）中表达较低。III组视网膜中nNOS和PSNO的表达水平显著低于I组和II组（图2（e）和2（f））。nNOS表达和蛋白S-亚硝基化的显著下调表明，这种NO介导的蛋白修饰可能在近视发病机制中起作用。

图2 I、II和III组视网膜中nNOS和PSNO的表达（a，b）I、II和III组视网膜中nNOS的表达。（c，d）I、II和III组视网膜中PSNO的表达。（e）I组、II组和III组视网膜中nNOS的表达（nNOS：红色荧光；DAPI：蓝色荧光）。（f）I组、II组和III组视网膜中PSNO的表达（PSNO，绿色荧光；DAPI，蓝色荧光）：（a）I组视网膜，（b）II组视网膜，，（c）III组视网膜，和（d）DAPI染色核。GCL：神经节细胞层；IPL：内丛状层；INL：内核层；OPL：外丛状层；ONL：外核层；PL：感光层（***P＜0:001，**P＜0:01，*P＜0:05）。

3. 近视小鼠视网膜组织中S-亚硝基化蛋白的位点特异性鉴定

为了全面了解蛋白质S-亚硝基化作用，我们使用了一种特定位点的蛋白质组学方法来表征近视（第III组）和对照（第II组）视网膜组织中S-亚硝基化蛋白质和修饰的Cys残基。在该方法中，我们首先通过生物素开关不可逆地生物素化近视和对照视网膜中的内源性S-亚硝基化蛋白质，然后进行胰蛋白酶消化、生物素亲和纯化，并使用Orbitrap Exploris TM 480质谱仪最终鉴定蛋白质和修饰位点。我们对每个实验组织和对照组织进行LC-MS/MS分析。阴性对照中鉴定的生物素化肽被排除在相应的S-亚硝基化数据集之外。在四组视网膜中，我们共鉴定出709个S-亚硝基化肽和595个S-亚硝基化蛋白。我们在近视眼和对照眼之间鉴定出19个差异修饰的修饰位点（倍数变化＜0:83，P＜0:05），其中与对照眼相比，近视眼中13个下调，6个上调（倍数变化＞1:2，P＜0:5，图3）。

图3 在不同位点绘制的火山图绿色表达下调，红色表达上调，黑色是差异修饰位点。蛋白质S-亚硝基化修饰位点是通过LIM与对照组获得的。

3.1 GO分类与富集分析

通过GO分类和GO富集分析，我们共分析了19个差异修饰位点（图4和图5）。结果表明，LIM近视模型中不同的S-亚硝基化修饰蛋白主要与以下生物过程（BP）有关：细胞代谢（GO:00044237）、细胞生长（GO:0048896，GO:00016049）、信号转导（GO:0007165）、正反馈调节和负反馈调节（GO:0008523，GO:00051094）、对应激和刺激的反应（GO:00050896，GO:00151716）等。在近视眼中，S-亚硝基化蛋白出现在不同的细胞成分（CC）中：细胞质（GO:00016020）、细胞核（GO:0005634）、细胞膜（GO:0016020）、核糖体（GO:00005840）等。近视眼中具有不同S-亚硝基化修饰的蛋白质被证明主要与以下分子功能（MF）有关：GDP/GTP酶活性（GO:0005096，GO:00055093，GO:0051020，GO:00005096）、视紫红质激酶活性（GO:0.0050254）等。

图4 LIM组和对照组视网膜不同S-亚硝基化位点的GO分类

3.2 KEGG通路分析

为了更好地理解蛋白质S-亚硝基化修饰在近视发病机制中的生物学作用，我们进一步分析了19个差异位点的KEGG通路（图6）。分析表明，S-亚硝基化位点富集在与蛋白质加工（mmu04141）、糖酵解/糖异生（mmu00010）、光电导（mmu04744）和HIF-1（mmu04066）相关的信号通路。

图5 LIM组和对照组视网膜中不同S-亚硝基化位点GO的富集

3.3 Motif富集分析

先前的研究表明，半胱氨酸残基两侧的氨基酸组成对半胱氨酸氧化还原介导的翻译后修饰的敏感性和特异性有很大影响。为了进一步了解蛋白质的环境驱动因素，我们使用Motif-X算法分析了II组和III组视网膜中19个不同位点的S-亚硝基化残基附近的氨基酸组成特征（图7）。结果表明，S-亚硝基化半胱氨酸残基附近含有碱性和酸性侧链的氨基酸残基高度表达，如碱性氨基酸赖氨酸（K）和酸性氨基酸谷氨酸（E）。提示酸碱序列可能在氧化还原修饰介导的近视病理过程中发挥潜在的促进作用。

图6 LIM组与对照组视网膜中S-亚硝基化KEGG通路的富集分析

4. LIM组视网膜ENO1和SNO-ENO1表达有差异性变化

近年来，缺氧已被证明是近视病理损伤的重要机制。ENO1是糖酵解途径最后一步的关键酶，与组织缺血和缺氧密切相关。对差异位点的分析发现，SNO-ENO1在近视眼视网膜中的表达下调。为了探讨ENO1在近视发病机制中的作用，我们通过免疫印迹法检测了I、II和III组视网膜中ENO1的表达。建模4周后，三组之间ENO1蛋白的表达没有显著差异（P>0:05，图8（a））。透镜诱导不会改变ENO1的蛋白表达水平。

图7 LIM组与对照组视网膜中S-亚硝基化位点差异的Motif分析

为了探讨ENO1是否参与S-亚硝基化调节近视，我们进一步检测了I、II和III组视网膜中SNO-ENO1的表达水平，并将同一样本中ENO1表达水平作为参考。研究发现，III组SNO-ENO1的表达水平显著低于I组（P=0:006，图8（b））和II左眼（P=0:036，图8）。I组和II组之间nNOS的表达没有显著差异（P=0:378，图8（b））。透镜诱导SNO-ENO1表达降低。

图8 在I、II和III组的视网膜中检测到ENO1和SNO-ENO1的表达将Input用作阳性对照组，并验证细胞裂解液中ENO1蛋白的存在。

讨论

近视，尤其是高度近视，作为一种高发的慢性眼病，造成了巨大的社会和经济负担。高度近视引起的玻璃体后脱离、脉络膜萎缩、视网膜变性、视网膜脱离、黄斑裂孔、黄斑出血等并发症是导致失明的主要原因。目前认为，异常视觉刺激引起的信号通路变化在近视的发生和发展中起着重要作用。有许多研究关注与近视相关的信号通路。已知NO通过经典的cGMP信号通路参与近视的调节。Fujii等人发现形觉剥夺降低了鸡视网膜-RPE-脉络膜iNOS mRNA的表达。另一项研究表明，形觉剥夺7 d后，剥夺组NOS活性低于对照组，但形觉剥夺14 d和21 d后，剥夺组NOS活性迅速升高，明显高于对照组。这种先减少后增加的趋势可能是通过急性和慢性缺氧诱导eNOS和nNOS的不同反应来调节近视的一种方式。此外，我们前期对豚鼠形态剥夺1周、2周、3周的研究结果表明，随着形觉剥夺时间的延长，与对照组相比，nNOS和cGMP的表达水平逐渐升高，两者之间存在正相关关系。

在本研究中，我们发现在透镜诱导4周后，近视小鼠视网膜中nNOS的表达水平显著低于对照组，这与先前的研究结果相反。我们推测，这种差异可能是由于动物模型、模型选择和建模时间的差异。由于LIM和剥夺性近视（FDM）在发病机制上属于两种不同的近视模型，NO的表达可能是不同的。

我们还推测NO可能在近视进展的不同阶段发挥不同的作用，并可能根据不同时间点NOS表达的变化动态调节近视的发生和发展。在后续研究中，为了更好地阐明NO在LIM发生发展中的作用，我们还需要在LIM模型中多时间点检测NOS等进一步的研究。

以往对NO的研究主要集中于经典的cGMP相关信号通路，特别是在神经系统中，已知NO激活重要的生理级联反应，并参与中枢神经系统中神经元分化和突触可塑性的调节。研究表明，NO和cGMP在海马、小脑、和纹状体的不同脑区的突触可塑性是必要的，而NO-cGMP相关信号通路在长时程增强（LTP）、长期抑郁（LTD）和学习中起着至关重要的作用。受损的NO和cGMP信号与神经退行性疾病和认知障碍的病因和进展密切相关。近年来，NO介导的S-亚硝基化修饰在疾病中的作用越来越受到关注。许多疾病，如动脉粥样硬化、恶性肿瘤、阿尔茨海默病、帕金森综合征、神经元变性和亨廷顿舞蹈症，都以异常的蛋白质S-亚硝基化产物为特征。也有研究人员分析了NO介导的视网膜S-亚硝基化作用的调节：Vielma等人通过玻璃体注射外源性NO供体发现与cGMP无关的大鼠ERG振幅增加，然后通过S-亚硝基化免疫荧光实验发现NO供体引起GCL和PLS-亚硝基化蛋白的增加，提示NO可能通过S-亚硝基化修饰改善视网膜功能。在另一项关于光照射和去除光照射的研究中，Bloom发现在光适应小鼠的视网膜中S-亚硝基化蛋白信号很强，而在暗适应小鼠的视网膜中几乎没有S-亚硝基化信号，证明视网膜组织的S-亚硝基化是光依赖性的。总之，这些研究突出了视网膜组织中广泛存在亚硝基修饰蛋白，并表明近视与包括光强度和光传导在内的信号密切相关，这可能受实验性近视模型的影响。然而，以往的研究未能证实NO介导的S-亚硝基修饰在近视发病机制中的作用。在这项研究中，我们发现近视视网膜中的PSNO显著低于对照组，免疫荧光显示PSNO在GCL、IPL和OPL层中的表达较高，但在INL和ONL层中表达较低。这些发现表明，近视视网膜中PSNO表达的减少可能与近视模型中光刺激的减少有关。我们通过对S-亚硝基化蛋白的位点特异性鉴定了19个差异修饰位点。使用生物信息学分析，我们发现差异修饰的蛋白质在与近视发生和发展相关的信号通路中富集，如能量代谢、光电导和HIF-1。因此，我们推测NO通过S-亚硝基化修饰参与近视的发生和发展。

差异位点分析显示，与对照组相比，HIF-1信号通路中SNO-ENO1的表达下调。研究表明，缺氧诱导的从线粒体呼吸到糖酵解的代谢重编程需要ENO1的参与，ENO1是糖酵解中的关键酶。ENO1也被报道与缺氧缺血性视网膜疾病有关。低氧和缺氧条件下，人视网膜色素上皮细胞中HIF-1和ENO1的表达显著上调。在随后的实验中，我们发现沉默ENO1不会影响缺氧诱导的血管内皮生长因子（VEGF）的含量，这表明ENO1可能参与了除VEGF以外的缺氧途径的调节。缺氧损伤是近年来提出的近视眼病理损伤的重要机制。以往有关近视缺氧的研究主要集中在巩膜，认为巩膜缺氧是近视的触发因素。质谱和免疫印迹的结果表明，近视和非近视小鼠之间ENO1的表达没有显著差异，但SNO-ENO1在近视视网膜中下调。最近的研究表明，缺氧是近视的关键机制，ENO1与缺氧缺血性视网膜疾病密切相关。我们推测ENO1可能通过缺氧信号通路中S-亚硝基化修饰和反硝化修饰的动态调节介导近视的发生和发展。我们进一步认为，SNO-ENO1可能是ENO1的一种失活形式。当组织处于S-亚硝基化状态时，ENO1以S-亚硝基化修饰的状态存在，而当组织缺氧时，SNO-ENO1被脱氮以激活ENO1并参与糖酵解过程。然而，迄今为止，当前研究还未能阐明该蛋白在世界各地的作用机制，这值得进一步研究和探索，尤其是在各种缺血性和缺氧性疾病以及近视的发生和发展中。

结论

考虑到所有这些证据，NO似乎通过S-亚硝基化修饰参与近视的发生和发展，而ENO1作为S-亚硝基化修饰的靶蛋白调节这一过程。我们通过位点特异性蛋白质组学鉴定了C57BL/6J小鼠视网膜组织中大量内源性S-亚硝基化蛋白及其修饰位点，共筛选了19个差异位点，与对照组相比，实验眼中13个位点下调，6个位点上调。这些差异位点涉及多种过程和信号通路，如光转换、缺氧和能量代谢，与近视密切相关。这些发现为近视发展中NO信号传导和S-亚硝基化提供了新的见解，也为基于蛋白质修饰的视网膜疾病的诊断和治疗提供了基础。

原文链接：  

https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/36439692/

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