综述|大连医科：脑瘫的整合多组学研究现状与展望（国人佳作）

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编译：微科盟Echo，编辑：微科盟Emma、江舜尧。

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导读

脑瘫（CP）是一组影响运动和姿势的非进行性神经发育障碍。CP的病因和诊断生物标志物是临床研究的热点。组学技术的最新进展，包括基因组学、表观组基因组学、转录组学、代谢组学和蛋白质组学，为进一步了解CP的病理生理学提供了新的参考，并为CP诊断生物标志物的鉴定提供了支持。这篇综述将为未来CP发病机制的基础研究、诊断生物标志物的鉴定以及CP的预防策略提供基础和建议。

论文ID

原名：Integrative Multi-Omics Research in Cerebral Palsy: Current Progress and Future Prospects译名：脑瘫的整合多组学研究现状与展望期刊：Neurochemical ResearchIF：4.414发表时间：2022.12通讯作者：刘晶通讯作者单位：大连医科大学附属第一医院、大连干细胞与精准医学创新研究院

主要内容

1. 介绍

CP是一组异质性的非进行性神经发育障碍，包括运动障碍，通常伴随着广泛的医学特征，包括智力残疾、自闭症谱系障碍、癫痫、言语和语言缺陷以及视觉和听觉障碍。此外，CP是最常见的儿童身体残疾，据估计，全世界每1000名活产中有2-3人患有CP。虽然CP被认为是一种儿童期疾病，但它是一种终生疾病，严重影响生活质量，给社会带来巨大负担。

CP的疾病严重程度、全球流行率和社会负担导致了大量关于病因和诊断生物标志物的临床研究。然而，由于疾病的显著异质性，CP的病因是复杂的，这导致了诊断和预防方面的挑战。据报道，虽然许多环境因素会增加CP风险，包括早产、出生窒息、流产史、不良妊娠、颅内出血等，但多达40%的CP病例病因不明。这一发现表明，需要多层次分析来阐明CP的发病机制。多组学研究可以通过整合来自不同组学平台的数据，包括基因组学、表观基因组学、转录组学、蛋白质组学和代谢组学，来全面了解疾病过程。到目前为止，越来越多的组学研究已经探索了CP的病理生理学，旨在确定CP临床诊断和治疗的生物标志物。

在这项研究中，据我们所知，我们系统地总结了目前CP的多组学研究。本综述的目的是为未来研究提供指导，重点是CP的发病机制、诊断生物标志物的鉴定和CP的预防策略（图1）。

图1. 脑瘫多组学研究概况

2. CP的基因组学研究

下一代测序（NGS），包括全基因组测序（WGS）和全外显子组测序（WES），可以识别导致家族性或偶发性CP病例的遗传因素，包括单核苷酸变异（SNV）、拷贝数变异（CNV）。

2.1 散发性CP中SNVs的研究

虽然CP的近亲家族提供了关于CP病因的遗传贡献的极好信息，但绝大多数CP病例是偶发性的。NGS的开发和实施可以在这些偶发病例中探索致病变异。

研究表明，与参考人类基因组序列相比，每个个体携带数百万个SNV和片段的多态性。根据ACMG实验室指南和建议，SNV或片段的多态性可分为致病性、可能致病、良性、很可能良性、不确定意义。

NGS技术的发展可以通过WGS、WES或靶向NGS在大规模散发CP病例中识别越来越多的致病性和可能致病性SNV和片段的多态性。基于NGS的基因组筛查结果已在数千名CP患者中得到证明（表1）。

表1. 散发性CP中SNVs或片段多态性的研究概况

在迄今为止研究的最大CP队列中，Moreno De Luca等人发现，1345名患者中有31.3%的患者具有致病性或可能致病性SNV和片段的多态性，使用外显子组测序。一些规模相对较小的CP队列的研究显示了更高的诊断率。然而，在一项针对8名不相关个体和一对CP双胞胎的研究中，使用WES没有将任何变异归类为致病性或可能致病性。

大多数包含患者父母三联体的队列比只有单联体的队列的诊断率更高。具体而言，1345名患者中的一个队列的诊断率为31.3%，而181名单胞胎CP患者中的一组诊断率为7.7%。其他研究也强调了这一差异，其总结在表1中。

对其他神经发育障碍（NDD）患者（包括部分CP患者）进行了另外三项研究。在一项对78名不同NDD患者的回顾性队列研究中，32名患者被证明具有WES测定的致病性或可能致病性变异，包括11例共12种变异的CP。764名肌张力障碍患者的队列包括56名诊断为特发性肌张力障碍CP的患者，其中37名患者具有WES测定的诊断SNV和片段的多态性。Kwong等人对31名运动障碍患者进行了外显子组测序，其中2名患者被诊断为CP，两名CP患者均具有致病性或可能的致病性变体。

CP患者的数量因研究而异，从2人到1345人不等。有害的SNV和片段的多态性的分子诊断产率的估计值在2.5%至66%之间，这主要是由于CP表型的高度异质性和不同的样本选择参数。大多数CP患者都是与父母一起筛查的。由于在没有父母遗传信息的情况下更难识别新的变异，基于三重基因的NGS已显示出比单例测序产生更高的诊断率。总共有881个致病性或可能致病性SNV和涉及375个不同基因的片段的多态性与CP相关。

2.2 散发性CP中CNVs的研究

CNVs是结构变体的子集，其长度从1千碱基（kb）到数百万碱基对不等，与参考基因组相比，其缺失或重复的拷贝数可变。可以使用CMA或NGS检测和识别CNV。根据ACMG指南，CNVs可分为致病性、可能致病、良性、很可能良性、不确定意义。越来越多的研究表明，CNVs可能是NDD病因的重要因素，如智力残疾、自闭症、癫痫和精神分裂症。最近的研究还表明，致病性或可能致病性CNV可能在CP病因中起作用（表2）。

表2. 散发性CP中CNVs的研究概况

三项研究报告了CNV对CP的诊断率超过10%。CNVs诊断率最高的研究是52名以色列隐源性CP患者的选定队列。在这项研究中，16/52（31%）的病例被发现具有致病性或可能致病性CNVs。McMichael等人最初使用定制的微阵列平台在50例（20%）高加索散发病例中发现了14例罕见的遗传性CNV，这些CNV与CP具有潜在的致病相关性。这些CNV包括与神经系统疾病相关的几个基因中的5个缺失和9个重复。Yechieli等人对45名隐源性CP患者进行了染色体微阵列分析，在8/45（17.8%）的病例中共发现8种致病性或可能致病性CNV。大多数研究报告CNV的诊断率低于10%。在Takezawa等人和Rosello等人进行的另外两项研究中，没有发现与CP相关的致病性或可能致病性CNV。

总结上述研究，CP中有害CNV的诊断率在1.9%至31%之间，这主要是由于CP队列选择和调查策略的差异。在这些CP患者中报告的致病性或可能致病性CNV涉及许多不同的染色体区域，这与CP的异质性遗传病因一致。目前，针对CNV在CP中的作用的研究尚处于起步阶段。因此，需要继续分析CNVs，以确定CNVs在CP病因中的作用。

2.3 家族CP研究

在同一代或不同代中，有一个以上受CP影响的个体的近亲家族为CP的遗传贡献提供了直接证据。在过去十年中，利用早期的连锁分析和纯合性图谱或目前的原发NGS，已经鉴定出许多单一致病基因与家族CP的孟德尔遗传有关（表3）。

表3. 家族性CP研究概况

采用全基因组连锁分析，在八个有多个常染色体隐性痉挛性CP患儿的巴基斯坦近亲家庭中的三个家庭中进行了家族性CP的首次研究。这项研究展示了一个纯合性区域，随后对这三个家族中的两个进行的研究将该基因座细化为一个特殊区域，其中包含候选基因GAD1。进一步的突变筛查证实了CP患者GAD1中一种新的纯合错义突变。

AP4复合物由AP4M1、AP4B1、AP4S1和AP4E1编码的四个亚基组成，参与细胞内运输。AP4M1、AP4B1、AP4S1和AP4E1的几种致病性变体已被独立地证明在多个不同的近亲家族中引起CP。在一个有五个患缺氧缺血性四肢瘫痪CP的兄弟姐妹的摩洛哥近亲家庭中，纯合子图谱和测序分析确定了染色体7q22上的一个14Mb纯合子区。该分析在所有5名患者中鉴定出AP4M1内含子14中的剪接供体位点纯合致病性突变，这与谷氨酸受体的细胞内运输有关。Jameel等人在一个有两名受影响的CP男性儿童的近亲巴基斯坦家庭中，使用WES在AP4M1中发现了一个新的纯合突变。该突变与攻击性行为、轻度畸形特征、智力残疾、痉挛性轻瘫和头围减少相关。Moreno De Luca等人在一个巴勒斯坦-约旦血亲家族中进行了临床染色体微阵列分析，该家族有两个兄弟姐妹患有常染色体隐性CP，并在涉及AP4E1的染色体15q21.2上发现了192 kb的纯合缺失。Abou Jamra等人在三个有八个CP患者的近亲家族中，使用图谱和Sanger测序进行了组合分析。在一个有三个患病兄弟姐妹的以色列-阿拉伯裔家庭中，检测到AP4B1的纯合插入导致移码突变和翻译提前终止。AP4S1中的一个无意义变体是在一个近亲家族中发现的，该家族由来自叙利亚中部的三个核心家族和三个受影响的兄弟姐妹组成。AP4E1中的纯合剪接供体位点突变和缺失导致6号外显子中的移码突变和翻译提前终止，该突变和缺失在一个由叙利亚北部两个核心家庭组成的近亲家庭中发现，该家庭有两个受影响的儿童。

KANK1、ADD3、PROC、ITPR1和NT5C2中的致病性变体在不同的CP近亲家族中被鉴定出来。在临床实践中使用NGS作为CP的一线检测有望导致CP相关基因数量的增加，尤其是在CP近亲家族。

3. CP的表观基因组学研究

DNA甲基化是多种生物过程和病理变化中基因表达的重要调节因素。CP基因相同的单卵双胞胎对不一致，为评估表观遗传因素的影响提供了一个理想的机会。在对4对CP不一致的单卵双胞胎进行的全基因组甲基化分析中，功能富集分析显示，差异甲基化基因（DMG）在大脑皮层萎缩和大脑萎缩中富集，这表明CP的发展可能与甲基化的改变有关。另一项包括15对CP不一致的单卵双胞胎的研究中的途径分析显示，MAPK信号、Ras信号、免疫应答、炎症信号、缺氧信号和细胞粘附发生变化。Croughey等人进行了一项甲基化研究，包括16名痉挛性CP患者和16名对照受试者。结果表明，DMG富含六种显著受影响的细胞信号传导途径：G蛋白偶联受体下游信号传导、嗅觉信号转导、PI3K-Akt信号传导途径、NOTCH1信号传导、靶向膜的信号识别颗粒依赖性共翻译蛋白和蛋白输出。在23例CP病例和21例未受影响的对照组的新生儿血液中进行的全基因组DNA甲基化分析发现，与神经元功能相关的几种典型途径被过度表达。这些途径包括神经运动损伤、主要脑结构畸形、脑生长、神经保护、神经元发育和去分化以及颅感觉神经元发育。富集分析确定了DMG参与与神经元发育和功能相关的多种信号通路，如细胞通讯调节等。然而，对极低胎龄CP新生儿的全基因组甲基化分析表明，出生前2周外周血细胞中反映的表观遗传变化在CP发病机制中发挥了有限的作用。

目前，CP的大多数表观基因组研究都集中在DNA甲基化，而不是组蛋白修饰。这些表观遗传学研究提供了DNA甲基化在多种途径和分子机制中全基因组变化的证据，这些途径和分子机理参与CP的发病。然而，表观遗传学变化与CP之间的因果关系尚未确定。因此，未来的研究包括在表观遗传学分析中评估组蛋白修饰，可能为CP的发病机制提供新的见解。

4. CP的转录组学研究

对于转录组，研究人员通常在CP病例和对照组之间选择差异表达的基因，以鉴定与CP发展相关的基因。

4.1 编码基因研究

首次大规模的CP转录组分析是在来源于182例临床异质性CP病例和20例对照组的淋巴母细胞系中进行的。该分析鉴定了387个显著差异表达的基因。功能富集分析显示CP中营养信号通路的下调和免疫应答的上调。对极低胎龄的CP新生儿进行的全转录组分析显示核糖体活性明显富集。

4.2 非编码RNA研究

越来越多的证据表明，非编码RNA在中枢神经系统和多种NDD中发挥重要的调节作用。一些研究已经研究了某些非编码RNA在CP中的作用，包括长链非编码RNA、小RNA和环状RNA。Li等人表明，维生素B1和B12通过MALAT1/miR-1轴上调BDNF和下游PI3K/Akt信号，以抑制CP大鼠的神经元凋亡并减轻神经损伤。他等人在CP大鼠中观察到转录因子TCTP和Myt1L的过度表达以及miR-200a的下调，并表明TCTP的表达减少导致miR-200a上调，进而限制Myt1L表达，从而改善行为并减少氧化应激。Wen等人表明，miR-135b通过S100B依赖性STAT3途径的失活诱导神经干细胞分化和增殖，从而抑制CP。Hu等人对五名患有CP的儿童及其健康双胞胎兄弟姐妹的血浆中的环状RNA进行了全基因组分析，并证明has_circ_0086354可能是早期诊断CP的新生物标志物。

目前，外周血已被频繁用于CP和其他NDD的大多数转录组学研究，因为其可用性高于脑组织。然而，很少有研究调查了CP中血液和脑标志物的对应关系，也没有进行空间转录组学研究来评估CP。因此，使用空间转录组构建CP患者脑组织中的全局基因表达谱可能为CP的病理发展提供新的理解。

5. CP代谢组学研究

代谢组是参与代谢的小分子化学物质的集合，可对其进行分析以确定代谢产物在生理学和疾病中的作用，并可用于识别诊断和预测疾病的生物标志物。一项初步研究使用1H NMR和直接注射液相色谱串联质谱（DI/LC-MS/MS）对9例CP患者和11名对照受试者的尾状核进行了靶向代谢组学分析。这是第一项在CP患者脑组织中进行代谢组学分析的研究。共鉴定和量化了222种代谢产物，其中谷氨酸是CP患者大脑中差异最大的代谢产物，这表明谷氨酸可能是CP的潜在生物标志物，雄激素/雌激素代谢是前三个显著改变的途径。本研究为进一步研究CP的复杂病理生理学以及识别CP潜在生化标志物的策略提供了基础。目前，CP的代谢组学研究很少。预计其他代谢组学研究将有助于识别CP的新生物标志物，并更全面地了解CP的发病机制。

6. CP的蛋白质组学研究

蛋白质组学是一种方法学方法，指同时从生物样本中分析许多蛋白质，以寻求功能性蛋白质和遗传数据之间的知识差距，并已广泛应用于识别许多疾病中的生物标志物。

对18名痉挛CP儿童和20名健康个体的血液样本进行蛋白质组学分析，以检测差异表达的蛋白质。最后，共鉴定了37种差异表达的蛋白质，其中发现碱性磷酸酶的基因表达产物TNAP（组织非特异性碱性磷酸酶）在痉挛性CP中下调，这在CP模型大鼠中也得到了验证，并表明TNAP是诊断和治疗痉挛性CP的有前途的分子。另一项高通量定量蛋白质组学研究应用于评估CP模型大鼠海马和运动皮层的蛋白质组学变化，鉴定了3600多种蛋白质。通路分析富集了细胞质核糖体蛋白、GPCR C类代谢型谷氨酸等通路，该研究为CP提供了潜在的新治疗靶点，并为未来的研究提供了研究基础。

虽然目前CP中的蛋白质组学研究很少，但越来越多的研究证明，蛋白质组学在NDD中识别新的生物标志物方面具有巨大潜力。相信在不久的将来，将有越来越多的蛋白质组学研究来阐明CP的发病机制。

讨论与展望

CP是一种复杂的疾病，由于各种临床类型、多种神经成像模式和多种发育病理所表明的异质性，使用统一的方法分析CP的策略无法充分描述CP的病因。因此，多组学方法的快速进展有望为CP的发病机制和发展提供新的见解。然而，多组学方法在CP中的临床应用仍面临若干挑战。一方面，非遗传风险因素仍然是大多数CP病例的主要原因，在临床实践中应保留基因测试，因为它主要用于找出CP的不确定发病机制。另一方面，CP的分析技术、足够的样本量和多维数据库仍然缺乏标准化。在不同CP队列中使用NGS技术，已鉴定出数百个与CP致病性密切相关的候选基因。此外，CNVs检测可提高患有智力障碍和多畸形的CP儿童的诊断率，而单基因识别或三基因WES可用于诊断具有家族史、缺乏高风险因素且脑部MRI扫描无特定发现的CP儿童。然而，专注于CP的基因组研究仍处于起步阶段，可能会发现更多与CP相关的基因，需要通过大队列测序进行验证。此外，在理解与遗传变异相关的分子机制方面仍然存在差距。与其他NDD不同，CP动物模型的可用性有限，无法进行功能性研究，这是增加对CP病理学的理解和开发新治疗方法的一个重要障碍。为了解决这一问题，需要未来的研究来构建CP的动物模型，以确定候选基因的功能相关性。此外，越来越多的研究表明，肠道微生物群和大脑之间存在相互作用，并且肠道微生物群已被证明在NDD中发挥重要作用。将多组学数据与肠道微生物组和临床数据相结合可能是下一个有潜力的方向，为CP的发病机制、诊断和治疗提供新的见解。原文链接：  

https://link.springer.com/article/10.1007/s11064-022-03839-y

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