科研 |浙江中医药：补阳还五汤抗脑缺血再灌注机制的多组学分析（国人佳作）

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编译：微科盟草重木雪，编辑：微科盟Emma、江舜尧。

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导读

补阳还五汤（BYHW）是清代王清任《医林改错》中治疗中风气虚血瘀证的经典代表方。然而，关于BYHW治疗中风的机制研究并不系统和全面。结合多组学分析方法，本研究探讨BYHW治疗脑缺血再灌注（I/R）的潜在靶点。我们通过建立大鼠大脑中动脉闭塞（MCAO）模型，研究BYHW对大鼠脑I/R损伤的影响。然后，我们通过蛋白质组学、转录组学和代谢组学方法分析BYHW治疗脑I/R损伤的潜在靶点和途径。最后，本研究使用4D-PRM（4维-平行反应监测）验证潜在靶点。BYHW有效改善了MCAO大鼠的神经功能评分，并显著降低了MCAO鼠的脑梗死发生率。多组学分析确定了15个潜在靶点和4个潜在信号通路。4D-PRM靶向蛋白质组学验证的结果表明，Pde1b反向上调，Aprt、Gpd1、Glb1、HEXA和HEXB反向下调。因此，BYHW可能通过Aprt、Pde1b、Gpd1、Glb1、HEXA和HEXB靶点，以及甘油磷脂代谢、嘌呤代谢和糖鞘脂生物合成-globoseries通路改善脑I/R。

论文ID

原名：Analysis of the mechanism of Buyang Huanwu Decoction against cerebral ischemia-reperfusion by multi-omics译名：补阳还五汤抗脑缺血再灌注机制的多组学分析
期刊：Journal of EthnopharmacologyIF：5.195发表时间：2022.12通讯作者：万海同 & 何昱通讯作者单位：浙江中医药大学

实验设计

实验结果

1. BYHW改善I/R诱导的大鼠大脑皮层梗死损伤
如图2所示，活体组织的TTC染色为深红色，右半球的梗死区域为白色。模型组的梗死面积比（21.73%，P < 0.001）显著高于假手术组（0.0%），BYHW组的梗死区域比（6.88%，P < 0.01）显著降低。表1 BYHW的组成和比例
图1 代谢组学：正离子模式（A）和负离子模式（B）下质控样品的主成分分析；正离子模式（C）和负离子模式（D）的火山图；正离子模式（E）和负离子模式（F）下的主成分分析模型；正离子模式（G）和负离子模式（H）下的差异离子簇分析图；蛋白质组学：差异表达蛋白质的火山图（I）和QC样品的主成分分析（J）；转录组学：火山图（K）和主成分分析（L）。
图2 各组大鼠代表性脑组织的TTC染色假手术组、MCAO组和1.31g/kg BYHW处理组（A）的2,3,5-三苯基氯化四氮唑染色冠状脑切片的代表性照片。（B）三组脑梗死面积的统计结果（n = 6）。与假手术组相比，*** P < 0.001，与模型组相比，### P < 0.0001。
2. BYHW可改善I/R诱导的大鼠神经行为损伤
假手术组、模型组和BYHW组之间的神经损伤评分显著不同（图3）。模型组的神经功能评分显著高于假手术组（P < 0.001），给药5天后，补充组显著低于模型组（P < 0.01）。图3 BYHW对MCAO后1h大鼠神经功能评分的影响数值表示为平均值± SD（n = 6）。***与假手术组相比，P < 0.001。##与模型组比较，P < 0.01。
3. 蛋白质组学和转录组学联合分析
当比较假手术组和模型组进行鉴定时，BYHW组筛选了蛋白质组学和转录组学中一致上调或下调的基因，获得了351个共享靶点，其中110个和241个分别反向上调和下调（图4）。反向上调意味着模型组与假手术组相比表达下调，但BYHW组与模型组相比表达上调，反向下调则相反。图4 BYHW组中共同靶点的直方图反向上调和反向下调的具体描述如图中虚线所示。
4. 蛋白质组学、转录组学和代谢组学联合分析
我们将模型组与BYHW组比较得到的代谢组数据按照方法中的筛选条件进行筛选，正离子模式和负离子模式识别的离子总数分别为262个和195个。差异离子与代谢产物数据库HMDB中的物质分子相匹配，结合数据库KEGG中的信息，我们共鉴定出78种差异代谢产物。为了探索大脑I/R大鼠中BYHW的代谢途径，我们使用MetaboAnalyst 5.0数据库的联合途径分析对识别的共同靶标和差异代谢物进行通路富集分析，最终获得代谢途径富集图。我们在图表上标记影响值> 0.2和P < 0.05的通路（图5）。图5 信号通路中富集和分布的气泡图节点大小与通路影响有关，节点颜色与-log10（p）值有关。通路影响>0.2且P<0.05的通路在图上标记为嘌呤代谢和糖胺聚糖降解。
基于信号途径富集分析的结果，主要富集于脑I/R差异代谢产物中的信号途径包括嘌呤代谢和糖胺聚糖降解。与这些通路相关的代谢产物有L-谷氨酰胺、1-（5′-磷酸核糖）-5-氨基-4-（N-琥珀酰甲酰胺）-咪唑、次黄嘌呤、肌苷、5-羟基异尿酸。图6 枢纽基因与其他基因之间的关系枢纽基因标记为红色和橙色，而非枢纽基因则标记为紫色
已识别的共享DEG和差异代谢物被导入Cytoscape 3.7.1的MetScape插件，我们共检测到58个DEGs和34个差异代谢物。为了识别BYHW对抗大脑I/R的关键基因，我们通过STRING 11.5构建了PPI网络。图6显示了44个相关DEG之间的总体关系，其余14个基因没有出现连接。枢纽基因是使用Cytoscape中的CytoHubba插件通过MCC算法计算的前20个基因。BYHW组的枢纽基因为Aprt、Gmps、Umps、Cat、Glb1、HEXB、Acox1、Hsd17b4、Crat、Prps2、Atic、Arsb、Cyb5r3、Pde1b、Gaa、Anpep、Lap3、Pp3ca、P4hb和Mapk8。在图中，枢纽基因被标记为红色和橙色，非枢纽基因被标为紫色。图7 ClueGO对潜在靶点的GO富集分析
为了找到BYHW抗脑I/R功能的潜在靶点，我们通过ClueGO进行了基因本体（GO）和京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集分析（图7和8）。GO分析中最高的项目为核糖核苷单磷酸代谢过程(GO: 0009161)、水解酶活性、作用于糖基键(GO: 0016798)、抗生素分解代谢过程(GO: 0017001)、视觉行为(GO: 0007632)、核苷酸-糖生物合成过程(GO: 0009226)、突触后密度膜的整体组分(GO: 0099061)、横纹肌细胞凋亡过程的调控(GO: 0010662)、NAD结合(GO: 0051287)、氨基糖代谢过程(GO: 0006040)。KEGG富集分析表明，具有显著影响的通路是糖胺聚糖降解、氨基糖和核苷酸糖代谢、癌症中的胆碱代谢、苯丙胺成瘾、谷胱甘肽代谢、嘌呤代谢、不饱和脂肪酸生物合成和谷胱甘肽代谢。图8 KEGG通路的ClueGO富集分析所有通路的P值< 0.05
为了充分了解BYHW对抗大脑I/R的机制，我们构建了基于代谢组学和网络药理学的交互网络（图9）。将差异代谢物导入Cytoscape 3.7.1数据库中的MetScape插件，以收集化合物-反应-酶-基因网络。通过将转录组学和蛋白质组学鉴定的潜在靶标与MetScape分析中的基因进行匹配，我们发现了15个关键靶标，包括Glb1、Pcyt1a、DGKI、Gpd1、Aprt、Gmps、Atic、Pde1b、Ak2、ATP2B2、HEXB、HEXA、Acox1、Hsd17b4、Hsd17b12（见表2），其中Glb1、Aprt、Gmps、Atic、Pde1b、HEXB、Acox1、Hsd17b4是关键基因。相关的关键代谢产物是磷脂酰乙醇胺、3-β-D-半乳糖基-sn-甘油、二酰甘油、胆固醇酯、1-酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1-（5′-磷酸核糖基）-5-氨基-4-（N-琥珀酰氨基）-咪唑、5-羟基异尿酸、肌苷、L-谷氨酰胺、次黄嘌呤、三己糖神经酰胺、5,6-环氧二十碳三烯酸、2-腺苷甘油。脑I/R的发生可能与甘油磷脂代谢、嘌呤代谢、鞘糖脂生物合成-globoseries和花生四烯酸代谢密切相关。它们可能在BYHW治疗脑I/R损伤的疗效中发挥重要作用。表2 有关关键靶点、代谢产物和途径的信息其中Glb1、Aprt、Gmps、Atic、Pde1b和HEXB为关键基因。
5. 4D-PRM验证
为了进一步验证发现阶段鉴定的差异蛋白，我们使用4D-PRM靶向蛋白质组学验证了3个样品中的15个靶蛋白。总的来说，总共有14种蛋白质被鉴定为靶蛋白，而Ak2在样品中没有得到验证。在测试的蛋白质中，六种显示出显著变化，其中Pde1b显示出反向上调，而Aprt、Gpd1、Glb1、HEXA和HEXB显示出反向下调（图10）。图9 BYHW的化合物-靶点-通路网络（A）花生四烯酸代谢。（B）甘油磷脂代谢。（C）糖鞘脂生物合成。（D）嘌呤代谢。红色六边形、灰色菱形、绿色圆形矩形和圆形分别代表活性化合物、反应、蛋白质和基因，其中深蓝色圆圈和浅蓝色圆圈分别代表枢纽基因和关键基因。关键代谢产物和基因是粗体的。
图10 脑组织中经4D-PRM验证的14种靶蛋白的直方图。PRM筛选和验证各种差异表达蛋白（DEPs）。每个数据点都是根据平均生物重复的平均值计算的。*** P < 0.001，# P < 0.05，## P < 0.001。

讨论

为了进一步探讨BYHW对大鼠脑I/R损伤的治疗机制，本研究首先通过三个组学分别分析了DEGs和差异表达的代谢物。其次，我们对转录组学和蛋白质组学反向DEGs进行了分析和讨论，并分析和讨论了相关的代谢途径。最后，我们对不同代谢产物与DEGs之间的关联进行了深入分析。通过数据处理和联合分析，本研究获得关键代谢产物和关键靶点，并聚焦相关代谢途径。我们发现，缺血侧脑组织中15种蛋白质和相应代谢产物的调节受到影响，BYHW处理显著改善了这些。包括Glb1、Pcyt1a、DGKI、Gpd1、Aprt、Gmps、Atic、Pde1b、Ak2、ATP2B2、HEXB、HEXA、Acox1、Hsd17b4和Hsd17b12。其中，Glb1、Aprt、Gmps、Atic、Pde1b、HEXB、Acox1和Hsd17b4是中枢基因，它们受甘油磷脂代谢、嘌呤代谢、鞘糖脂生物合成- globoseries和花生四烯酸代谢的影响。对15种靶蛋白进行了4D-PM验证，获得了14种蛋白的结果（Ak2没有验证结果），其中6种蛋白显示出统计学差异。Pde1b反向上调，而Aprt、Gpd1、Glb1、HEXA和HEXB反向下调。

缺血性脑卒中的药物治疗与多种代谢途径有关，包括甘油磷脂代谢、花生四烯酸代谢、嘌呤代谢和糖磷脂生物合成。

动脉粥样硬化易感和年龄匹配的抗动脉粥样硬化模型之间鉴定出显著改变的代谢产物，揭示了甘油磷脂代谢途径的变化。这些脂质不仅是生物膜的结构成分，还在与动脉粥样硬化相关的重要细胞过程中充当信号分子和生物活性介质，包括血管生成、细胞凋亡、炎症和增殖。研究者们已经发现，对中风的保护作用可能与甘油磷脂代谢过程中磷脂酶A活性的抑制和花生四烯酸产生的抑制有关。花生四烯酸代谢在影响冠状动脉或脑血管区域的动脉粥样硬化血栓形成事件中起关键作用。环氧化酶（COX）是健康和疾病中花生四烯酸代谢的关键酶，在冠心病和脑血管疾病的发生和发展中发挥重要作用，如减轻疼痛和炎症、增加血压和增加动脉粥样硬化血栓事件的风险。嘌呤代谢产物水平可用于开发机器学习模型，以预测重大心血管事件的风险。嘌呤能信号已被证明可调节血管功能和病理过程，包括炎症和动脉反应，并在缺血性中风的预后中发挥作用。代谢途径的富集分析表明，短暂性全脑缺血后，嘌呤代谢途径在海马CA1和CA3区富集，表明在MCAO模型中逆转嘌呤代谢的意义。脑缺血开始于脑能量供应减少和高能量需求之间的失衡，不可避免地与嘌呤代谢密切相关。糖磷脂合成的抑制导致血管性血友病因子（VWF）的体外分泌增加，由于其在血小板血栓形成中的作用，VWF可能导致血栓形成和动脉粥样硬化。

BYHW可在脑I/R的预防和治疗中发挥多层次、多靶点的作用。Gpd1已显示出抑制脯氨酰羟化酶3（PHD3），后者阻断HIF1α的脯氨酰羟基化和随后的蛋白酶体降解，从而通过抑制甘油-3-磷酸脱氢酶2（GPD2）增强对线粒体功能和AMPK磷酸化的抑制。Gpd1的复杂杂合突变可导致肝脏肥大、脂肪性肝炎和高甘油三酯血症。半乳糖苷酶β1（Glb1）基因的常染色体隐性突变导致溶酶体β-gal缺乏，引起含半乳糖底物的积累，并引发进行性和致命性神经退行性溶酶体贮积症GM1神经节苷脂贮积症。Glb1缺乏不仅是一种神经节苷脂积累障碍，而且是一种广泛的寡糖病，包括许多β-连接的含半乳糖的聚糖和糖缀合物，包括糖脂、N-连接的聚糖和各种O-连接的聚糖。研究发现，三种嘌呤生物合成酶（PFAS、PAICS和Atic）在大鼠海马神经元中表达并广泛分布，这些酶池与线粒体有关。影响大脑功能的嘌呤和嘧啶代谢的变化沿着合成和分解途径传递，Atic属于合成途径。PDE1是目前PDE酶超家族中最具代表性的基团。PDE1有三种亚型，其中磷酸二酯酶-1b（Pde1b）主要分布于大脑皮层，并在纹状体、齿状回、CA3和黑质中高度表达。通过不同的缺血性中风模型，科学家们研究了小胶质细胞释放外泌体的机制及其在调节神经轴突形态和神经元存活中的作用。研究发现，pde1b自噬通量和外泌在大脑皮层缺血后上调机体释放中起作用。研究发现Pde1b调节海马体的空间记忆和情境记忆。据报道，梗死周围区域局灶性大脑中动脉闭塞后，小胶质细胞中Pde1b的表达逐渐增加。此外，Pde1b敲除或抑制显著增强了BV2细胞的自噬通量。β-氨基己糖苷酶（HEX）负责鞘糖脂神经节苷脂GM2的转化。HEX有三种不同的异构体，由两个基因座HEXA和HEXB的组合表达产生：HEXA、HEXB和HEXS。分析表明，HEXB分别是Mir-352的直接靶点。Mir-352主要在缺血性卒中后下调，随后在MCAO后1至7天略微恢复到基线水平。已知miRNA在大脑的生理和病理过程中发挥重要作用，涉及神经元的发育、分化、凋亡和增殖。研究表明，miRNA调节神经元死亡，并在缺血性中风的进展中存活。关于HEXB，大脑炎症、溶酶体储存和神经肌肉功能障碍是HEXB缺乏的标志。HEXB小鼠的表型与慢性炎症患者的表型相似，表现为星形胶质细胞和小胶质细胞的激活。Acox1催化酰基辅酶A去饱和生成2-反式烯酰基辅酶A，这是脂肪酸β-氧化途径中的第一种酶，也是过氧化物酶体β-氧化过程中的主要限制酶。低Acox1表达（与较低的Acox1活性相关）可能导致氧化应激（过量产生O₂、H₂和一氧化二氮（NO））和线粒体功能障碍，Acox1缺乏导致严重的脑功能障碍和损伤。尽管相关文献中尚未报道这些靶点Aprt、Gmps、Pcyt1a、DGKI、Ak2、ATP2B2、Hsd17b4和Hsd17b12，但我们相信它们是未来脑缺血再灌注研究的良好潜在靶点。

结论

总之，研究表明BYHW对大鼠大脑I/R具有治疗作用。通过蛋白质组学、转录组学和代谢组学的综合分析，BYHW在大鼠脑缺血再灌注中的保护机制可能与甘油磷脂代谢、嘌呤代谢、鞘糖脂生物合成globular series和花生四烯酸代谢有关。相关靶点主要集中在炎症、自噬和凋亡。上述研究表明，多组学的联合分析是评估中医疗效和探索其作用机制的有效工具。此外，它还可以用来预测这种中成药的治疗靶点。本研究中通过4D-PRM验证的6种靶蛋白在脑I/R损伤的治疗中也发挥了重要作用。未来对它们的进一步确认和研究将提供对这种蛋白质在脑缺血中的作用的更深入的理解。另一方面，脑缺血的病理生理意义和分子机制可以为中风生物标志物的研究提供更多的候选蛋白。原文链接：  

https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/36581164/

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