科研（IF:38.104） |中国医学科学院：SARS-CoV-2劫持细胞激酶CDK2促进病毒RNA合成（国人佳作）

 点击蓝字“蛋白质组”,轻松关注不迷路

生科云网址：https://www.bioincloud.tech/

---

编译：微科盟Wicro，编辑：微科盟Emma、江舜尧。

微科盟原创微文，欢迎转发转载。

导读

2019年冠状病毒病 (COVID-19) 大流行摧毁了全球健康。确定SARS-CoV-2 RNA复制所必需的关键宿主因子有望揭示细胞靶标，以开发广谱抗病毒药物，这些药物可以为未来的病毒爆发做好准备。在这里，我们使用基于质谱 (MS) 的蛋白质组学方法鉴定了与非结构蛋白12 (nsp12)相关的宿主蛋白，非结构蛋白 12是SARS-CoV-2的RNA依赖性RNA聚合酶 (RdRp)。在候选因子中，细胞周期蛋白依赖性激酶的一员CDK2（细胞周期蛋白依赖性激酶 2）与 nsp12 相互作用并导致其在T20磷酸化，从而促进由nsp12、nsp7和nsp8组成的RdRp复合物的组装，促进高效病毒RNA的合成。我们的观察进一步支持了CDK2在病毒RdRp功能中的关键作用，即CDK2抑制剂可有效损害病毒RNA合成和 SARS-CoV-2感染。综上所述，我们发现 CDK2是SARS-CoV-2 RdRp复合物的关键宿主因子，因此为开发SARS-CoV-2 RdRp抑制剂提供了一个有希望的目标。

论文ID

原名：SARS-CoV-2 hijacks cellular kinase CDK2 to promote viral RNA synthesis译名：SARS-CoV-2劫持细胞激酶CDK2促进病毒RNA合成期刊：Signal Transduction and Targeted TherapyIF：38.104发表时间：2022.12通讯作者：岑山, 王健伟, 郭斐通讯作者单位：中国医学科学院北京协和医学院

实验设计

实验结果

COVID-19大流行是由冠状病毒SARS-CoV-2引起的，给全球健康造成了严重负担。 SARS-CoV-2属于冠状病毒科，是一种有包膜的单链正链RNA病毒。与其他冠状病毒一样，SARS-CoV-2基因组编码orf1a和1b中的16种非结构蛋白(nsps)，4种结构蛋白，以及几种辅助蛋白。SARS-CoV-2经历了不断的进化，产生了高度可传播的关注变体 (VOC)，例如Delta和Omicron毒株，它们受到许可的COVID-19的保护较少疫苗和对基于单克隆抗体的疗法具有耐药性。因此，一直迫切需要有效的抗SARS-CoV-2药物来缓解正在进行的COVID-19大流行，并为未来的病毒爆发做好准备。病毒RNA的复制对于SARS-CoV-2的传播至关重要，它是由病毒RNA依赖性RNA聚合酶(RdRp)驱动的。 RdRp复合体由三部分组成nsp7、nsp8和 nsp12。Nsp12是一种932个氨基酸长的引物依赖性RNA聚合酶，在N末端包含巢状病毒RdRp相关核苷酸转移酶 (NiRAN) 结构域和一个右端C端的RdRp结构域，由接口结构域连接。Nsp8作为RNA引物酶，为nsp12生成短寡核苷酸引物，它在SARS-CoV-2复制中的基本功能使RdRp复合物成为主要寻找药物靶点并进行了深入研究，尤其是其结构和与细胞因子的相互作用。已通过亲和纯化质谱法(AP-MS)鉴定出多种宿主蛋白与病毒RdRp相关联。最近的研究表明，除了其聚合酶活性外，SARS-CoV-2 nsp12还可以劫持宿主RIPK1（受体相互作用的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶 1)和抑制IRF3（干扰素调节因子3）的核转位，从而拮抗宿主抗病毒先天免疫，从而促进病毒感染。此外，病毒RdRp被证明与METTL3（甲基转移酶 3）相互作用，调节其苏木化和泛素化，从而影响其定位和表达，并调节SARS-CoV-2 RNA的m6A修饰。然而，关于 SARS-CoV-2 RdRp活性是否以及如何受宿主蛋白调节, 知之甚少。在这项研究中，我们通过基于质谱 (MS)的蛋白质组学方法寻找与SARS-CoV-2的RdRp相关的宿主蛋白，并发现细胞周期蛋白依赖性激酶的成员CDK2与nsp12相互作用并诱导nsp12在氨基酸T20处磷酸化，从而促进RdRp复合物的组装并促进病毒RNA的合成。因此，CDK2抑制剂可有效抑制病毒RNA合成和SARS-CoV-2复制。 CDK2是一种蛋白激酶，在调节细胞分裂中起着关键作用。研究表明，CDK2可以修饰病毒蛋白并创造有利于病毒复制的环境，方法是通过破坏细胞周期进程来抵消细胞限制。我们的数据从而揭示了CDK2在调节病毒RdRp功能中的新功能，并表明CDK2作为开发病毒RdRp抑制剂的靶标。
1. CDK支持SARS-CoV-2 RdRp介导的基因表达
为了鉴定调节SARS-CoV-2 RNA合成的细胞蛋白，我们首先进行了免疫沉淀和质谱法(MS)，以确定与SARS-CoV-2 RdRp相关的细胞蛋白。简而言之，将带有Flag标签的nsp7、带有Flag标签的nsp8和带有Flag标签的nsp12质粒共转染到HEK293T细胞中，并使用抗Flag-M2珠子将细胞裂解物中的带有Flag标签的蛋白质免疫沉淀下来。通过蛋白质印迹检测共转染细胞中nsp7、nsp8和nsp12的表达（图 1a）。将免疫沉淀样品加载用于SDS-PAGE，然后进行考马斯蓝染色。除了病毒nsp7、nsp8和nsp12，可见蛋白条带出现在免疫沉淀样品中的约35KD 位置（图 1b），将其提取用于液相色谱-质谱法（LC-MS）分析。鉴定了84种分子量在30 KD和40 KD之间的宿主蛋白（补充表 S1）。值得注意的是，两种细胞周期蛋白依赖性激酶 (CDK)、CDK1（细胞周期蛋白依赖性激酶 1）和CDK2位列前20名（图 1c）。 CDK已被证明可以通过调节细胞周期进程、克服细胞限制因子以及与病毒 RNA 聚合酶结合来调节RNA 病毒的复制。因此，我们推测SARS-CoV-2可能劫持细胞CDK以促进病毒RNA复制。图1. CDKs参与SARS-CoV-2 RdRp的活性a. Flag标记的nsp7、nsp8、nsp12或Flag载体在HEK293T细胞中共转染。抗 Flag M2亲和凝胶用于共免疫沉淀，并使用指定的抗体进行蛋白质印迹分析。 b. 通过SDS-PAGE分离免疫沉淀的样品，然后进行考马斯蓝染色。星号 (*) 表示用于质谱分析的波段。 c. 质谱显示的前20个候选基因。 d, e. 表达CoV-Gluc、nsp12、nsp7、nsp8质粒DNA的HEK293T细胞以1:10:30:30（d）或对照载体和CoV-Gluc（e）的比例用CDK1或CDK2 siRNA转染（三个每个基因的 siRNAs）48小时。然后测量上清液中的 Gluc 活性。通过蛋白质印迹分析确定CDK1/2敲低。 f、g. 表达CoV-Gluc、nsp12、nsp7、nsp8质粒DNA 的HEK293T细胞以上述比例（f）或对照载体和CoV-Gluc（g）用CDK2/CyclinA质粒或CDK1/CyclinB质粒转染4小时.在上清液中测量Gluc 活性。通过qRT-PCR检测到CDK1/2过表达。实验在d–g中至少进行了3次，数据以mean±SD表示； *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001且ns不显著（双尾未配对学生t检验）。
与我们的假设一致，最近的一项多组学研究表明，CDK家族的许多激酶在SARS感染期间通过相互作用介导信号转导，并充当功能中枢。更重要的是，几种特异性CDK抑制剂可有效治疗癌症。这些CDK抑制剂可以重新用作治疗SARS-CoV-2感染的有效疗法。因此，我们选择CDK在本研究中进行进一步研究。为了测试这一点，我们首先使用CoV-RdRp-Gluc报告分析系统测量了CDK 敲低对 SARS-CoV-2 RNA合成的影响，如前所述。在该分析中，荧光素酶基因包含5'和3'未翻译SARS-CoV-2的区域(UTR)及其表达由CMV启动子驱动。当表达Gluc mRNA时，病毒UTR允许该mRNA被病毒RdRp识别和扩增，导致Gluc表达显著增加，从而报告SARS-CoV-2 RdRp的活性。如蛋白质印迹分析所示，用siRNA敲低CDK1或CDK2后，荧光素酶活性水平显著降低（图 1d），而在未表达的对照细胞中未观察到荧光素酶活性的显著变化病毒RdRp（图 1e）。这些数据表明CDK2和CDK1在SARS-CoV-2 RdRp的功能中发挥积极作用。接下来，我们过表达CDK2或CDK1，并观察到表达病毒RdRp的细胞中荧光素酶活性增加了1.5倍（图 1f、补充图 1c），而对照细胞中荧光素酶显著降低（图 1g，补充图 1d）。此外，我们检查了其他候选基因如ETFA、OTUB1和CDK5（CDK 家族的另一个成员）是否也参与了SARS-CoV-2 RdRp介导RNA合成。结果表明，用siRNA沉默这些基因中的任何一个对荧光素酶活性没有显著影响（补充图 1a、b），支持CDK1和CDK2在刺激SARS-CoV-2 RdRp介导的RNA中的特定作用合成。
2. CDK2与SARS-CoV-2 nsp12相互作用
我们接下来进行了免疫共沉淀和蛋白质印迹，通过转染细胞一起或单独表达nsp7、nsp8或nsp12来验证和进一步检查CDK1和CDK2与RdRp复合物之间的相互作用。结果显示CDK2与RdRp复合物以及nsp12本身的特异性关联，并且CDK2关联对于nsp8弱得多，对于nsp7检测不到（图 2a）。与CDK2相比，在免疫沉淀材料中检测到极少的CDK1，并且未检测到CDK5（图（图 2a）。为了进一步检查CDK2与nsp12的特异性相互作用，我们进行了邻近连接测定 (PLA)，它显示了与单个荧光点的原位蛋白质-蛋白质相互作用。如图2b所示，在表达nsp12的细胞中观察到最多的红色荧光点，在表达nsp8的细胞中观察到的红色荧光点较少，在表达nsp7的细胞中观察到的红色荧光点很少，这与Co-IP数据一致（图 2a）。计算PLA红色荧光点的数量，PLA结果显示CDK2与nsp12的结合比nsp7和nsp8分别增加了28倍和2.7倍（图 2c）。与单独的nsp12相比，RdRp观察到的相互作用焦点更少（图 2c），这可能是由于 nsp12在共转染nsp7、nsp8和nsp12的细胞中的表达水平低于仅在细胞中的表达水平表达nsp12（图 2a）。这些数据共同证明了CDK2和nsp12之间的相互作用，这使得CDK2能够促进RdRp活性，如图1所示。为了测试CDK2是否直接与nsp12结合，我们因此通过生物层干涉测定法（BLI 测定法）测量了CDK2和nsp12之间的结合亲和力，该测定法广泛用于蛋白质相互作用的分析和表征。CDK2以浓度依赖性方式表现出对nsp12的结合亲和力，平衡解离常数 (KD)为260 ± 41nM（图 2d）。与 BLI 结果一致，在体外 GST pull-down 试验中显示 CDK2 直接与nsp12结合（图 2e）。总之，这些结果表明nsp12与CDK2直接结合。图2. CDK2与nsp12相互作用a. 内源性CDK2与HEK293T细胞中的Flag-nsp7、Flag-nsp8和Flag-nsp12相互作用。 Anti-Flag M2亲和凝胶用于共免疫沉淀，并通过免疫印迹分析免疫沉淀物。 b. 原位邻近连接测定(PLA)和共聚焦成像显示 HEK293T细胞中内源性CDK2与 Flag-nsp7、Flag-nsp8、Flag-nsp12（红色）的相互作用。细胞核用DAPI（蓝色）复染。比例尺，5μm。 c. 在随机选择的细胞中计算 PLA红色荧光点的数量。 n =‟每组10个细胞。数据表示为平均值±SD。在 nsp12组和nsp8组之间应用双尾未配对学生 t检验。在nsp12组和nsp7组之间进行双侧Mann-Whitney检验，***P < 0.001。 d. Octet测定法检测CDK2与nsp12的结合，并显示了结合亲和力常数。将纯化的CDK2蛋白稀释至不同浓度（125、250、1000 和 2000 nM），然后将nsp12蛋白（50 μg/mL）生物素化并捕获在链霉亲和素(SA)生物传感器上。显示了CDK2蛋白的结合和解离曲线。 e. 6*His标记的nsp12在体外被 GST标记的CDK2拉低，然后用指定的抗体6*His或GST分析nsp12和CDK2 蛋白。
3. CDK2增强SARS-CoV-2 RdRp的RNA合成
接下来，我们通过执行RT-qPCR评估了CDK2敲低对CoV-RdRp-Gluc报告基因检测中正链和负链RNA水平的影响。结果表明，通过三种siRNA中的任何一种敲低CDK2可将负链和正链Gluc-RNA的水平降低40-75%，而对nsp7、nsp8或nsp12的表达没有可测量的影响(图 3a)。同时，CDK2敲低不影响不表达病毒RdRp的对照细胞中正Gluc-RNA的表达(图 3b）。从HeLa细胞获得了相同的发现（补充图 2a，b）。此外，我们发现CoV-RdRp-Gluc系统中的负链RNA水平随着CDK2水平的升高而显著升高（图 3c）。这些结果支持CDK2在协助SARS-CoV-2 RdRp介导的RNA表达中的作用（图 1）。图3. CDK2敲低特别损害RdRp的活性a、b. 表达CoV-Gluc、nsp12、nsp7、nsp8质粒DNA的HEK293T细胞以 1:10:30:30 (a)或对照载体和 CoV-Gluc (b)的比例用三种 siRNA 特异性序列转染 CDK2。48小时后，通过qRT-PCR检测负链或正链Gluc-RNA，并通过蛋白质印迹分析检测蛋白质表达。 c. CoV-Gluc、nsp12、nsp7、nsp8质粒DNA按上述比例共转染HEK293T细胞，然后将一系列CDK2/CyclinA浓缩质粒转染到六孔板中。48小时后，通过qRT-PCR检测负链Gluc-RNA，并通过蛋白质印迹分析检测蛋白质表达。数据表示为平均值± SD、*P < 0.05、**P < 0.01、***P < 0.001且ns不显著（双尾未配对学生t检验）。
4. Nsp12被CDK2磷酸化以进行有效的RNA合成
鉴于CDK2的激酶活性，CDK2与nsp12的结合可能导致nsp12或病毒 RdRp 复合物的其他成分磷酸化，从而影响RdRp的活性。为了测试这一点，我们使用了一种活性CyclinA-CDK2复合物方法，其中CDK2的底物被活性CyclinA-CDK2复合物磷酸化，并且该反应被λ蛋白磷酸酶(λ-PPase)抑制。将表达CDK2、CyclinA、nsp7、nsp8和nsp12的质粒共转染到HEK293T细胞中，然后用λ-PPase处理细胞裂解物。结果显示一条nsp12条带在用λ-PPase处理后丢失（图 4a），而从表达nsp7或nsp8的细胞裂解物中未观察到条带（补充图 3a), 表明只有nsp12作为CDK2的底物。为了进一步验证nsp12可以被CDK2磷酸化，我们首先在体外评估了在 CDK2与CyclinA2形成复合物的情况下nsp12的磷酸化水平，这是通过ADP-GloTM激酶检测试剂盒确定的。该测定法测量由激酶反应产生的ADP的发光信号，该信号与激酶活性呈正相关。结果表明，将纯化的nsp12添加到激酶反应混合物中会产生强烈的发光信号（图4b），表明发生了激酶反应。此外，在激酶反应缓冲液中使用纯化的CDK2、Cycliln A和nsp12进行了另一项体外激酶测定，导致蛋白带与Pho-CDK2特异性抗体反应（图 4c）。总之，我们的结果强烈表明nsp12是CDK2的底物。为了验证这一结果，我们通过免疫沉淀的nsp12的液相色谱-质谱分析确定了nsp12的磷酸化位点。数据揭示了nsp12中T20处的CDK家族磷酸化位点（图 4d），但未发现nsp7和nsp8的此类磷酸化位点（数据未显示）。总之，我们的结果强烈表明nsp12在氨基酸T20处被CDK2磷酸化。图4. CDK2对nsp12的磷酸化增强了RdRp活性a. Flag-nsp12、Myc-CDK2和HA-CyclinA在HEK293T细胞中共转染 48小时。Flag标记的nsp12蛋白根据之前的实验方法进行免疫沉淀，然后用或不用λ-PPase处理，然后用针对Pho-CDK2底物、Flag、HA和Myc的抗体进行免疫印迹。 b. CDK2/CyclinA激酶酶系统与ADP-GloTM检测。纯化的 nsp12或组蛋白H1在含有50μM ATP和6.4ng活性CDK2/CyclinA的激酶反应混合物中孵育。实验一式四份进行。数据显示为平均值±SD，双侧Mann–Whitney检验，*p < 0.05。 c. 体外CDK2/CyclinA激酶测定。纯化的CDK2/CyclinA与重组蛋白nsp12体外磷酸化系统一起孵育。收集反应混合物并使用免疫印迹检查。 d. 通过质谱法(MS)鉴定nsp12中的磷酸化位点。 e、f. CoV-Gluc、Flag-nsp7、Flag-nsp8、Flag-nsp12或T20突变体nsp12在 HEK293T细胞中共转染48小时。负链Gluc-RNA通过RT-qPCR进行定量。用指定的抗体通过免疫印迹分析细胞裂解物。 g. HEK293T细胞用Flag-nsp7、Flag-nsp8、Flag-nsp12 突变体 T20E、Gluc-RNA质粒和单个siRNA转染48小时。通过RT-qPCR定量负链Gluc-RNA，并通过蛋白质印迹分析检测蛋白质表达。实验一式三份进行。数据显示为均值±SD，双尾未配对学生t检验在e–g中，***P < 0.001，ns不显著。
为了揭示nsp12在T20磷酸化的功能相关性，我们构建了两个nsp12突变体，磷酸化模拟T20E和非磷酸化T20A，并检查了它们在CoV-RdRp-Gluc报告基因检测中支持病毒RNA合成的能力。结果表明，在野生型或突变型nsp12的表达水平相似的情况下，与野生型nsp12相比，T20A突变使负链RNA水平降低了60%以上（图 4e)，磷模拟nsp12突变体T20E在RNA表达方面与野生型nsp12 一样有效（图 4f）。这表明在T20处的nsp12磷酸化在支持有效的病毒RNA合成中的重要性。重要的是，我们观察到磷模拟物T20E或T20A的负链RNA合成不受CDK2敲低的影响（图 4g，补充图 3c），支持CDK2刺激RdRp功能的机制通过磷酸化nsp12中的T20。综合起来，这些数据表明nsp12被CDK2磷酸化，并且CDK2对nsp12的磷酸化增强了RdRp活性。
5. CDK2促进RdRp复合物的形成
接下来，我们研究了CDK2介导的nsp12在T20磷酸化如何影响病毒RNA合成。首先，我们敲低了CDK2并检查了对nsp12表达的影响。三对不同的CDK2 siRNA均未改变nsp12的水平，表明CDK2诱导的nsp12在T20磷酸化不影响nsp12表达（补充图 4）。我们进一步评估了CDK2沉默对共免疫沉淀测定中RdRp复合物形成的可能影响。使用靶向nsp7/8-Flag的抗Flag-M2珠子拉下细胞裂解物中的RdRp复合物，然后进行蛋白质印迹以使用HA抗体检测HA-nsp12。结果显示，当CDK2被敲低时，与nsp7/8-Flag共沉淀的HA-nsp12的量减少了1.7倍（图 5a）。为了支持Co-IP数据，PLA测定结果显示，nsp12与nsp7或nsp8之间的相互作用随着CDK2敲低而显著减少（图 5b）。总之，这些数据表明CDK2在细胞中RdRp复合物形成中的重要作用。图5. CDK2稳定RdRP复合体a. 用对照siRNA或CDK2 siRNA转染HEK293T细胞，然后用表达Flag标记的nsp7/8和HA标记的nsp12的载体转染。根据先前的实验方法对细胞裂解物进行免疫沉淀。实验一式三份进行，并使用ImageJ对蛋白质印迹进行量化。数据显示为平均值±SD，*P < 0.05（双尾未配对学生t检验）。 b. 原位邻近连接测定(PLA)和共聚焦成像显示HA-nsp12与Flag-nsp7、Flag-nsp8（红点）在用对照siRNA或CDK2 siRNA转染的HEK293T细胞中的相互作用。细胞核被DAPI（蓝色）染色。比例尺，5μm。随机选择的细胞中PLA红色荧光点的数量，每组n=10个细胞。数据显示为平均值±SD，双侧Mann-Whitney检验，***P < 0.001。 c. Flag标记的nsp7/8和HA标记的nsp12或各种nsp12突变体在HEK293T细胞中共转染48h。抗Flag M2亲和凝胶用于共免疫沉淀，并使用指定抗体进行蛋白质印迹分析。d. 原位邻近连接测定和共聚焦成像显示HA标记的nsp12或nsp12突变体与HEK293T细胞中的Flag-nsp7、Flag-nsp8（红点）的相互作用。显示了代表性数据。细胞核被DAPI（蓝色）染色。比例尺，5μm。 e. 随机选择的细胞PLA红色荧光点的数量，每组n =10个细胞。数据显示为平均值±SD，T20E组和WT组（宽型）之间的双尾未配对学生t检验，T20A组和WT组之间的双侧Mann-Whitney检验，**P < 0.01，*** P < 0.001。 f. HEK293T细胞用对照siRNA或CDK2 siRNA转染，然后用表达Flag标记的nsp7/8和HA标记的nsp12 T20E突变质粒DNA的载体转染。 Anti-Flag M2亲和凝胶用于共免疫沉淀，并使用针对HA、Flag、CDK2或微管蛋白的抗体进行蛋白质印迹分析。
为了确定CDK2是否通过nsp12中T20的磷酸化增强RdRp复合物的形成，我们检测了Co-IP和PLA测定中的T20A和T20E nsp12突变体，如上所述。结果表明，在野生型或突变型nsp12的表达水平相似的情况下，与野生型相比T20A突变导致nsp7/8/12 RdRp复合物的数量减少33%，而磷模拟T20E突变导致沉淀的nsp7/8/12复合物增加两倍（图 5c）。为了支持Co-IP数据，PLA结果显示T20A nsp12与nsp7/8的相互作用显著降低，而T20E nsp12突变体与nsp7/8的相互作用显著降低（图 5d，e）。此外，我们注意到CDK2敲低不影响nsp7/8免疫沉淀物中T20E nsp12的数量（图 5f），这与该nsp12突变体在CDK2上催化RNA合成的独立性一致（图4f）, 提示CDK2在RdRp复合物的形成和功能中的作用是磷酸化nsp12的T20氨基酸。
6. CDK2抑制剂SNS-032阻断SARS-CoV-2复制
CDK2对病毒RNA合成的增强作用促使我们测试CDK2抑制剂是否可以抑制SARS-CoV-2感染。为此，我们在CoV-Gluc报告基因检测中评估了总共17种CDKs抑制剂。每种抑制剂的药物靶点描述靶点可在补充表S3中找到。前13种抑制剂要么对CDK2具有特异性，要么对包括CDK2在内的多种CDK具有广泛的活性，其余三种对CDK1、CDK7、CDK9和CIK具有特异性。与DMSO对照组相比，所有CDK2抑制剂均有效抑制Gluc活性，13种中有10种抑制超过60%，而其他CDKs抑制剂均未显示任何抑制作用（图 6a），提示CDK2抑制剂在抑制SARS-CoV-2 RdRp活性方面的特异性。为了进一步支持这一结论，与CDK1抑制剂Ro-3306对高达7 μM的Gluc表达没有显著影响（图 6b），比报道的针对CDK1的IC50 110 nM高600多倍。最后，我们评估了抗病毒活性通过感染Vero细胞并通过使用RT-qPCR量化病毒基因组RNA来测量病毒感染，SNS-032对SARS-CoV-2（MOI为 0.05）的影响。如图 6c所示，SNS-032处理也强烈抑制了活SARS-CoV-2在Vero细胞上的感染。 SNS-032以剂量依赖性方式显著抑制SARS-CoV-2感染，EC50为84nM（图 6d）。总之，这些结果将CDK2确定为抗SARS-CoV-2药物的潜在靶标。图6. CDK2抑制剂SNS-032阻断SARS-CoV-2复制a. CoV-Gluc、nsp12、nsp7 和 nsp8质粒以1:10:30:30的比例共转染 HEK293T细胞。转染后12小时，向细胞中加入不同的CDK家族抑制剂化合物 (10μM)。24小时后测试葡萄糖活性。测试在三个独立实验中进行，数据显示为平均值±SD。 b. CoV-Gluc、nsp12、nsp7和nsp8质粒DNA以上述比例共转染到HEK293T细胞中。 12小时后，将系列稀释的抑制剂SNS-032和Ro-3306添加到HEK293T细胞中。孵育24小时后测量Gluc活性。实验一式三份进行。 c. Vero细胞用1.22、19.53、312.5、5000 nM SNS-032处理，然后以MOI =0.05 感染SARS-COV-2。使用qPCR确定病毒感染。实验进行了两次。误差线表示平均值±SD。 d. 计算SNS-032的EC50。 e、f. Flag标记的 nsp7/8和HA标记的nsp12 (e)或HA标记的nsp12 T20E突变体(f)质粒DNA被共转染到HEK293T细胞中。转染后12小时，将连续稀释的抑制剂SNS-03（e：0、0.039、0.6μM；f：0、0.039、0.15、0.6μM）添加到HEK293T细胞中。孵育24小时后，使用抗Flag M2亲和凝胶进行共免疫沉淀，并使用针对HA、Flag的抗体进行蛋白质印迹分析。
为了探索SNS-032如何抑制SARS-CoV-2复制的机制，我们在Co-IP测定中评估了SNS-032对RdRp复合物形成的影响。结果显示，在SNS-032存在的情况下，HA-nsp12的数量显著减少，表明SNS-032对RdRp复合物的形成具有抑制作用（图6e）。相反，在用磷模拟T20E突变体替换宽型nsp12后，Co-IP测定显示SNS-032对复合物形成没有影响（图 6f）。总之，我们的结果表明SNS-032 靶向CDK2并通过阻断nsp12的T20氨基酸磷酸化来抑制RdRp复合物的形成。

讨论

在这项研究中，我们已将CDK2确定为与SARS-CoV-2 RdRp相关并促进病毒RNA复制的宿主因子。具体而言，我们的数据显示CDK2与nsp8和nsp12相互作用（图 2），是有效病毒RNA合成所必需的（图 3），在氨基酸处磷酸化nsp12 T20（图 4），并促进RdRp复合物的形成（图 5）。我们进一步表明，CDK2介导的nsp12在T20磷酸化是RdRp活性和RdRp复合物组装所必需的。综上所述，我们的数据支持SARS-CoV-2劫持CDK2使nsp12磷酸化，这反过来又有助于RdRp复合物的组装并确保病毒 RNA的有效合成。

作为病毒RNA复制所必需的酶，因此也是重要的抗病毒靶点，许多RNA病毒的RdRps已得到深入研究；然而，RdRp的翻译后修饰及其在病毒RNA复制和感染中的作用正在研究中。一项研究报告了丙型肝炎病毒 (HCV) RdRp被蛋白激酶C相关激酶2磷酸化及其在支持HCV RNA复制中的作用。这里，我们举了另一个例子，SARS-CoV-2 nsp12，即RdRp酶，在T20被细胞激酶CDK2磷酸化，这是RdRp功能和RdRp复合物组装所必需的。检测其他冠状病毒的RdRps是否也是CDK2的底物以及它们的RNA合成功能是否依赖于CDK2介导的磷酸化是关键，这可能会导致针对CDK2的泛冠状病毒抗病毒药物的开发。

LC-MS分析显示T20是nsp12的唯一磷酸化位点（图 4c）。 T20磷酸化在nsp12功能中的重要性得到T20A突变体受损的RNA合成活性和磷模拟突变体T20E的野生型活性的支持。由于GPS2.1软件还预测T226和T926是被CDK2磷酸化的潜在位点，我们测试了T226A和T926A突变体，它们显示病毒RNA合成适度减少（补充图 3d），而磷模拟T226E或T926E突变体显示出野生型水平的活性（补充图 3e）。 T226和T926可能充当CDK2的次要或次要磷酸化位点，并且还有助于nsp12 RNA合成功能。特定的pT20、pT226和p926抗体将有助于验证它们在nsp12背景下的磷酸化以及它们在RdRp功能中的潜在不同作用。此外，我们分析了SARS-CoV-2 VOC中nsp12的氨基酸序列，包括 Alpha (B.1.1.7)、Beta (B.1.351)、gamma (P.1)、Delta (B.1.617.2) , 并且只鉴定了四种不同的氨基酸。目前，不能排除nsp12中的这些突变可能影响其与CDK2相互作用的可能性。然而，发现T20在不同菌株之间高度保守，这表明CDK2介导的T20磷酸化可能在SARS-CoV-2变体之间共享。

目前尚不清楚T20磷酸化如何增强nsp12与nsp7/8的相互作用。结构研究表明nsp12的一个β-发夹（由N末端的D29到K50组成）插入由NiRAN和手掌形成的凹槽中，从而导致稳定整个RdRp结构的多个紧密相互作用。T20位于上游β-发夹的结构，以及这个灵活的20个氨基酸N末端区域的功能在很大程度上仍然未知。 T20磷酸化可能通过增强nsp12与nsp7/8的相互作用或稳定RdRp复合物来促进RdRp复合物的形成。

据报道，有几种病毒以细胞CDK为目标，从而破坏细胞周期进程/克服病毒感染的细胞限制。还表明，SARS-CoV-2感染可能导致CDK1/2活性降低，从而导致S/G2停滞并可能创造有利于病毒复制的细胞条件。此外，有人提出冠状病毒SARS-CoV的N蛋白在这些病毒中高度保守，并可能与细胞周期蛋白D相互作用，从而抑制CDK活性。我们在此展示了RdRp与CDK1和CDK2的关联。 CDK1或CDK2表达会影响RdRp功能，尽管CDK1抑制剂对病毒复制影响不大。鉴于CDK1被认为在G2/M期发挥重要作用，而CDK2被报道在晚期 S期促进有丝分裂，CDK1和CDK2可能在细胞周期的不同阶段在调节病毒复制方面发挥不同的作用.除了保证病毒RNA合成的相互作用功能外，这也可能有助于调节病毒感染的细胞周期。

CDK抑制剂已被用作癌症治疗方法，并在临床试验中进行了评估。在我们针对SARS-CoV-2 RdRp活性测试的17种CDK抑制剂中，所有14种CDK2抑制剂均显示出显著的抑制活性。特别是，CDK2抑制剂SNS-032对SARS-CoV-2 RdRp的抑制作用最强，可显著抑制SARS-CoV-2感染。SNS-032（以前称为 BMS-387032）最初是由 Bristol-Myers Squibb 药物研究所（康涅狄格州斯坦福德）作为CDK2的选择性抑制剂发现的。随后的研究表明，SNS-032通过干扰CDK7来抑制肿瘤细胞的增殖和CDK9的IC50分别为62和4 nM。需要更多的研究来确定SNS-032的强抗SARS-CoV-2活性是否也取决于CDK7或CDK9的抑制。先前报道的SNS-032的CC50值约为EC50的14到70倍，这与我们的数据一致，显示Vero细胞中的CC50值为87μM（补充图 5），表明SNS-的可接受选择性指数032用于治疗SARS-CoV-2感染。

总之，我们的研究揭示了一种调节SARS-CoV-2 RdRp功能的新机制，即通过病毒劫持细胞激酶CDK2磷酸化氨基酸T20处的RdRp。由于其他冠状病毒也可能依赖CDK2或其他CDK来进行有效的病毒RNA复制，因此CDK抑制剂有望被重新用作泛冠状病毒抗病毒药物。

原文链接：  https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/36575184/

----------微科盟更多推荐---------- 

获取此文献原文PDF、申请加入学术群，联系您所添加的任一微科盟组学老师即可，如未添加过微科盟组学老师，请联系组学老师46，无需重复添加。

请关注下方公众号

了解更多蛋白质组知识