科研 |中国药大&南京林业：通过谱效关系和蛋白质组学揭示贝母抗非小细胞肺癌的活性成分及其作用机制（国人佳作）

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编译：微科盟-草重木雪，编辑：微科盟Emma、江舜尧。

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导读

贝母（FB）被广泛用作治疗肺经疾病的传统药物。目前研究者们已经证明FB具有良好的抗非小细胞肺癌（NSCLC）活性。然而，其活性成分和潜在机制尚不清楚。本研究通过谱效应关系和蛋白质组学揭示FB抗NSCLC的生物活性成分及其潜在机制。首先，我们通过UHPLC-QTOF-MS对FB提取物进行化学分析，并通过细胞计数Kit-8测定评估FB提取物对A549细胞活力的抑制作用。其次，我们采用正交偏最小二乘回归分析，通过将化学特征与相应的抑制作用相关联来筛选潜在的活性化合物。第三，从体外细胞增殖、细胞周期和细胞凋亡以及体内肿瘤生长等方面进一步研究了潜在活性成分的抗NSCLC活性。最后，我们利用蛋白质组学揭示了潜在的抗NSCLC机制。本研究通过谱效应关系筛选出了六种潜在的活性成分，包括贝母甲素、贝母乙素、浙贝丙素、去氢鄂贝定碱、伊贝辛和贝母辛。其中，浙贝丙素对A549细胞活力具有较高的抑制作用，IC50值为36.93 μM。蛋白质组学和蛋白质印迹分析表明，浙贝丙素可以通过下调CDK1、CDK2、Cyclin A2、Cyclin B2的表达并抑制p53的磷酸化来阻止细胞周期。此外，参与p53信号通路的蛋白质（包括PCNA、14-3-3σ、CHEK1）显著降低，这表明浙贝丙素通过p53信号通路影响细胞周期进展。这项研究不仅为FB抗NSCLC的临床应用提供了科学依据，而且表明浙贝丙素是一种有前景的抗NSCLC先导化合物，值得进一步研究。

亮点：1. 谱效应关系揭示了贝母中6种潜在的活性甾体生物碱；2. 分析了甾体生物碱结构与活性的关系，发现浙贝丙素在体内外均表现出良好的抗肿瘤活性；3. 应用蛋白质组学和免疫印迹技术探讨浙贝丙素抗NSCLC的作用机制；4. 浙贝丙素通过下调CDK1、CDK2、Cyclin A2、Cyclin B2的表达来延缓细胞周期。

论文ID

原名：Revealing active components and action mechanism of Fritillariae Bulbus against non-small cell lung cancer through spectrum-effect relationship and proteomics  译名：通过谱效关系和蛋白质组学揭示贝母抗非小细胞肺癌的活性成分及其作用机制期刊：PhytomedicineIF：6.656发表时间：2023.01通讯作者：李会军 & 姜艳通讯作者单位：中国药科大学天然药物活性组分与药效国家重点实验室&南京林业大学化学工程学院

实验设计

实验结果

1. 通过谱效应关系发现了FB中潜在的活性成分

我们应用UHPLC-QTOF-MS/MS分析33个FB样品的化学成分（图1a），在样品分析过程中插入质控样品进行质量控制。如图S2所示，所有具有高度重叠色谱图的质控样品在主成分分析（PCA）图中聚集在一起，这意味着分析系统具有良好的稳定性和再现性。R（版本4.0.5）使用XCMS中的CentWave参数（ppm=15，峰值宽度：20–60 s，噪声：5000）和MetNormalizer（minfrac.qc:0，minfrac.sample:0，优化：True，倍数：5，线程：4）提取了33个FB样本的数据矩阵，包括保留时间（tR）、m/z和归一化峰值强度。

图1 利用OPLS-R模型建立谱效应关系不同FB样品的总离子色谱图（a）和抑制率（b）；潜在活性成分的VIP值（c）和相关系数（d）。
表1 通过谱效应关系分析了FB中潜在的活性成分

我们在A549细胞上评估了33批次FB样品的细胞毒性。如图S3所示，FB在25–300μg/mL范围内以浓度依赖性方式降低A549细胞的活力，这是通过谱效应关系发现活性成分的前提；然后选择50μg/mL的浓度进行细胞毒性评估。FB样品的化学变化表现出不同的细胞毒性分布，在15-85%的范围内变化（图1b）。

图2 潜在化合物对A549和BEAS-2B细胞活力的影响。顺铂浓度为25 μM

为了发现潜在的抗肿瘤成分，我们利用OPLS-R模型将200种化学特征与FB样品的细胞毒性相关联。R2Y=0.849和Q2=0.589的参数表明该模型具有良好的解释和预测能力。置换检验表明模型没有过度拟合（图S4）。应用OPLS-R模型，得到各变量在投影(VIP)值中的变量重要度和相关系数。VIP代表模型中个体变量影响的重要性，而相关系数反映每个变量对细胞毒性的正或负贡献。这里，VIP＞2且相关系数＞0的成分被认为是潜在的活性成分（图1c和d）。然后筛选出6个潜在活性组分，包括峰83、23、67、99、158和149。它们的结构分别鉴定为贝母乙素、伊贝辛、贝母甲素、贝母辛异构体、浙贝丙素和去氢鄂贝定碱（表1）。

图3 浙贝丙素和去氢鄂贝定碱对集落形成的影响（a）；细胞周期（b）；以及A549的凋亡（c）。在集落形成试验和细胞周期中，顺铂的浓度分别为6.25μM和12.5μM，细胞凋亡试验中顺铂的浓度为25μM。

2. 评价潜在活性成分的体外抗肿瘤活性

2.1 比较了潜在活性成分的细胞毒性

基于环E和F之间的连接模式，六种潜在活性组分共享具有六个碳环或杂环的C27胆甾烷碳骨架，被分为两种类型。其中，贝母甲素、贝母乙素、浙贝丙素和去氢鄂贝定碱的特征在于六环苯并[7,8]芴[2,1-b]喹嗪核，属于cevenine类生物碱。伊贝辛和贝母辛异构体属于E环呋喃部分的cevenine型生物碱。考虑到峰99（初步鉴定为贝母辛异构体）无法获得，贝母辛被用作替代品来研究结构-活性关系。如图2所示，去氢鄂贝定碱、浙贝丙素、贝母甲素、贝母乙素、伊贝辛，贝母辛的IC50值分别为33.80±0.46、36.93±0.88、171.00±0.28、108.65±0.64、202.50±4.38和94.24±2.69μM。同时，我们采用正常肺表皮细胞系BEAS-2B研究细胞毒性作用。结果表明，所有受试组分对BEAS-2B的细胞毒性远弱于对A549细胞的细胞毒性（图2）。显然，在六种候选成分中，浙贝丙素和去氢鄂贝定碱是最有效的。因此，我们选择这两种分子进行进一步研究。

图4 浙贝丙素对A549异种肿瘤体内生长的影响每天给予高剂量和低剂量浙贝丙素的肿瘤异种移植裸鼠2周（a）。在实验结束时用非疼痛麻醉处死的小鼠分离的肿瘤（b）和测量的重量（c）；每天使用卡尺测量各组的肿瘤体积（d）；每天监测各组体重（e）；肿瘤标本的H&E、Ki-67和TUNEL免疫组化染色图像，比例尺= 100μm（f）；心脏、肝脏、脾脏、肺和肾脏的代表性H&E染色图像，比例尺=100μm（g）。数据以平均值± SD（n = 5）表示。

2.2 浙贝丙素和去氢鄂贝定碱抑制A549细胞增殖

为了进一步探讨浙贝丙素和去氢鄂贝定碱对NSCLC的影响，进行了集落形成和流式细胞术检测。从图3a中可以看出，浙贝丙素和去氢鄂贝定碱均以剂量依赖的方式显著抑制A549细胞的集落形成。同时，浙贝丙素和去氢鄂贝定碱显著增强G0/G1期细胞，降低S期细胞（图3b）。此外，细胞凋亡分析表明，浙贝丙素和去氢鄂贝定碱在促进细胞凋亡方面显示出类似的作用（图3c）。其中，浙贝丙素在25 ~ 100 μM范围内对集落形成具有较好的抑制能力。与顺铂（一种著名的抗肿瘤药物）相比，浙贝丙素对A549细胞具有选择性细胞毒性，对BEAS-2B细胞毒性较小（图2和图S5）。因此，我们选择了浙贝丙素进行后续调查。

图5 蛋白质组学的结果DEPs火山图（浙贝丙素给药组与对照组）（a）；DEPs的GO富集分析，其中BP表示与生物过程相关的蛋白质，CC表示与细胞成分相关的蛋白质；MF表示与分子功能相关的蛋白质（b）；差异表达蛋白的KEGG途径富集分析（c）；GSEA关于细胞周期（d）。

3. 浙贝丙素在体内抑制肿瘤生长

为了评估浙贝丙素在体内的抗癌作用，我们使用A549细胞建立了稳定的皮下异种移植瘤模型。每组切除的肿瘤如图4a和b所示。可以看出，浙贝丙素通过降低平均肿瘤大小和重量显著抑制了肿瘤生长，对小鼠体重没有明显影响（图4c-e）。具体而言，浙贝丙素在10和20mg/kg剂量下分别剂量依赖性地抑制A549异种移植瘤生长25.74%和52.13%。如图4f所示，浙贝丙素处理后，细胞连接不紧密，细胞间隙扩大。Ki-67是肿瘤活检的增殖指数，用于反映肿瘤生长能力。在浙贝丙素组中，Ki-67在肿瘤切片中明显减少（图4f）。此外，我们进行了末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记（TUNEL）测定，以研究对肿瘤细胞凋亡的影响。从图中可以看出，浙贝丙素处理组中的绿色荧光略有增强。在心脏、肝脏、脾脏、肺和肾脏的HE染色切片中，浙贝丙素组没有显著变化（图4g）。这些结果表明，浙贝丙素在体内可显著抑制A549异种移植瘤的生长并促进其凋亡，而无明显毒性。

图6 蛋白质组学揭示了浙贝丙素抗NSCLC的潜在机制DEPs和NSCLC相关基因之间的交叉（a）；富集的KEGG途径（b）；靶点-疾病PPI网络按程度中心性排序（c）。

4. 蛋白质组学揭示了浙贝丙素的潜在抗NSCLC靶点

我们应用基于TMT的定量蛋白质组学分析浙贝丙素处理的A549细胞的蛋白质。应用1.20倍的上调截止值和0.83倍的下调截止值，我们共发现683个DEPs，其中467个蛋白上调，216个蛋白下调（图5a）。基因本体（GO）分析表明，569个蛋白质与蛋白质结合有关，143个蛋白质与细胞增殖有关，81个蛋白质与有丝分裂细胞周期有关（图5b）。京都基因和基因组百科全书（KEGG）分析表明，DEPs在细胞增殖、细胞粘附、有丝分裂、铁死亡和类固醇生物合成中富集（图5c）。基因集富集分析（GSEA）用于识别功能显著富集或缺失的蛋白质类别，并且细胞周期在GSEA分析中显著富集，具有下调趋势（图5d）。

为了进一步研究浙贝丙素的关键抗NSCLC靶点，我们从癌症基因组图谱（TCGA）数据库中收集了18475个NSCLC相关基因(https://portal.gdc.cancer.gov/)。在684个确定的DEPs中，659个DEPs与NSCLC相关（图6a）。这些DEPs在DNA复制、细胞周期、细胞粘附、有丝分裂、铁死亡、p53信号通路和类固醇生物合成的途径中富集（图6b）。在蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络中，我们计算每个DEP的中心度（DC）。如图所示，具有高DC值的CDK1、CDC20、CCNA2、KIF11、TOP2A、BUB1、AURKB、PLK1、CCNB2和BUB1B被确定为浙贝丙素治疗NSCLC的前十大枢纽靶点。其中，KIF11是促进细胞周期过程的有丝分裂特异性驱动蛋白。CDK1、CCNB2、PLK1和CCNA2是调节G1/S和G2/M相变的关键蛋白。BUB1、BUB1B、AURKB和CDC20参与后期姐妹染色单体的分离。TOP2A在转录过程中调控DNA的拓扑状态，这与基于铂的耐药性高度相关。枢纽靶点在不同阶段参与有丝分裂细胞周期，提示细胞周期阻滞可能是浙贝丙素的主要机制。

图7 用浙贝丙素（25、50和100μМ）处理的A549细胞中CDK1、CDK2、CCNA2（Cyclin A2）、CCNB2（CyclinB2）的表达（a）；蛋白质组学测定的PCNA、14–3–3σ、CHEK1的相对强度（b）；用浙贝丙素处理的A549细胞中p-p53/p53的相对密度（c）。

5. 浙贝丙素通过p53信号通路阻滞A549细胞周期

由于CDK1、CDK2、细胞周期蛋白A2（CCNA2）和细胞周期蛋白B2（CCNB2）是调节G1/S和G2/M相变的下游蛋白，因此我们选择这四种蛋白进行进一步验证。如图7a所示，浙贝丙素以剂量依赖的方式显著下调CDK1、CDK2、Cyclin A2和Cyclin B2，这与蛋白质组学的结果一致。此外，蛋白质组学中上游蛋白如PCNA、14–3–3σ、CHEK1减少（图7b）。其中，CHEK1可以促进p53的磷酸化，增加PCNA和14–3–3σ的表达，以调节细胞周期进程。免疫印迹结果表明浙贝丙素显著抑制p53的磷酸化（图7c），这表明浙贝丙素诱导的细胞周期阻滞可以通过p53信号通路调节（图8）。

图8 浙贝丙素抗NSCLC的作用机制

讨论

中药的多种化学成分和靶点构成了发现生物活性物质的挑战。在本研究中，我们使用UHPLC-QTOF-MS对FB的化学成分进行了表征，并通过谱效应关系筛选出了六种甾体生物碱，即贝母甲素、贝母乙素、浙贝丙素、去氢鄂贝定碱、伊贝辛和贝母辛异构体，作为潜在的抗NSCLC组分。从结构上看，贝母甲素、贝母乙素、浙贝丙素和去氢鄂贝定碱属于反式D/E-cevanine生物碱，而伊贝辛和贝母辛则属于蒜藜芦碱类生物碱。考虑到前四种分子和后两种分子对A549细胞的细胞毒性没有显著差异，我们可以得出结论，甾体骨架C17-C23处的连接不是其生物活性的主要原因。另一方面，imperiline（一种典型的顺式D/E cevanine）对A549细胞显示出相对较弱的细胞毒性（IC50>200μM，图S6），表明D/E环的融合构型在发挥cevanine碱的细胞毒性中起着关键作用。

图9 六种活性生物碱的构效关系分析IC50与H供体的相关性分析（a）；IC50与H受体之间的相关性分析（b）。

为了进一步探索甾体生物碱的结构-活性关系，我们根据其2D结构计算了六种分子的物理化学性质（表S2），发现甾体生物碱的活性与氢键受体/供体的数量高度相关（图9），这是影响化合物吸收或渗透性的重要因素。根据先前的报告，H键供体/受体的数量越少，跨膜双层的渗透性越好。这可能是浙贝丙素和去氢鄂贝定碱比其他两种活性更强的原因之一。

关于作用机制，先前的研究表明，甾体生物碱通过Hedgehog信号通路、NF-κB信号通路、caspase-3依赖性凋亡、细胞周期阻滞和自噬发挥抗肿瘤活性。例如，贝母乙素和贝母辛通过阻滞G0/G1期的细胞周期来抑制癌细胞增殖。川贝酮调节Bcl-2、Bax和caspase-3的表达，导致细胞周期阻滞和细胞凋亡。Ki-67是一种重要抗原，在活性细胞周期（G1、S、G2和M期）中优先表达，但在静止细胞（G0期）中不表达，通常用于反映细胞增殖能力。在浙贝丙素处理的异种移植小鼠中，我们发现Ki 67显著下调，浙贝丙素可以在体外阻滞A549细胞周期G0/G1期。这意味着细胞周期阻滞是通过浙贝丙素抑制肿瘤生长的最重要途径之一。

细胞周期蛋白和细胞周期蛋白依赖性激酶（CDK）是驱动有序细胞周期相变的关键调节因子。CDK1/2和CDK4/6可通过与细胞周期蛋白A、B、D和E的结合激活细胞周期并促进G1/S和G2/M的转换。在这项研究中，浙贝丙素显著降低了CDK1/2和Cyclin A2/B2的表达。此外，细胞周期通常由多种途径调节，如ATR-CHK1/ATM-CHK2、JAK-STAT、p53、NF-κB和PI3/AKT/mTOR信号通路。其中，p53信号通路是一个复杂的细胞应激反应系统，具有广泛的输入和下游效应，对其作为肿瘤抑制通路的功能至关重要。先前的研究表明，CHEK1可以影响p53的磷酸化，并进一步调节DNA损伤、细胞周期阻滞和凋亡。在此，我们发现p53信号通路相关蛋白（包括CHEK1、PCNA和14-3–3σ）显著下调，p53的磷酸化也明显改变，表明浙贝丙素通过调节p53信号通路阻滞A549细胞周期。

结论

在本研究中，我们通过谱效关系揭示了FB中的活性甾体生物碱用于治疗NSCLC。浙贝丙素在体外和体内被证明是具有良好抗NSCLC活性的主要成分。此外，浙贝丙素可以剂量依赖性地降低CDK1、CDK2、Cyclin A2和Cyclin B2的表达，并抑制p53的磷酸化，这表明浙贝丙素通过调节p53信号通路来阻滞A549细胞周期。总之，本研究阐明了FB的抗NSCLC成分，并揭示了潜在的作用机制，为FB对NSCLC的临床治疗提供了科学证据。

原文链接：  

https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/36587416/

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