Circular RNAs 的生物发生、功能和挑战

Original JunJunLab 老俊俊的生信笔记 2022-08-15

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介绍

今天分享一篇 2020 年发表在 Molecular Cell 上的一篇综述：

通讯作者是 陈玲玲博士 ，陈玲玲博士是中国科学院分子细胞科学卓越中心首席研究员，上海生物化学与细胞生物学研究所（SIBCB）分子生物学国家重点实验室副主任。陈博士长期以来一直对环状和长链非编码 RNA 在正常细胞功能和疾病中的作用感兴趣。是这个领域的专家，并发表了多篇高分文章。

以下是陈博士的网上实验室：

今年发了 science、cell research，真牛！

文章

摘要：

共价闭环的环状 RNA（circRNAs）是由真核生物中数千个基因外显子的前体 mRNA 后剪接 产生的。环状 rna 通常在 低水平上表达，并经常表现出 细胞类型特异性 和 组织特异性 的模式。最近的研究表明，它们的生物发生需要剪接体机制，并可以被顺式互补序列和蛋白因子。大多数环状 rna 的功能在很大程度上仍未被探索，但已知的功能包括隔离 microRNA 或蛋白质、调节转录和干扰剪接，甚至翻译成产生多肽。然而，由于环状 RNA 的环状构象和序列于与线形 mRNA 重叠，因此理解它们的调控在多个层次上存在挑战。本文综述了环状 RNA 生物发生和功能的最新进展，并讨论了环状 RNA 研究中的技术障碍。

背景

环状 RNA 在 25 年前被发现。当时只发现了少数的环状 RNA，而且它们通常被认为是几乎没有功能潜力的异常剪接副产物。由于其非线性构象和缺乏多聚腺苷酸(多聚(A))尾巴，通常用 poly(A)+RNA 的富集的方法很难富集到，因此环状 RNA 在下一代 RNA 测序(RNAseq)谱中很少出现。只有用非poly(A)rna或用 RNaseR 富集环状 RNA，这是一种优先消化线性 RNA 的酶，才发现了环状 RNA 的广泛表达。例如，在来自蠕虫和果蝇的后生动物中发现了超过 10,000 个环状 RNA，到小鼠、猴子和人类，在植物、真菌和原生生物中也发现了环状 RNA 的广泛表达。

最近对环状 RNA 生物合成的研究表明，反向剪接是由典型的剪接体机制催化的，并由内含子互补序列(ICSs)和 RNA 结合蛋白质(RBP)来调节。新的研究表明，一些环状 RNA 与神经元功能、先天免疫反应、细胞增殖和多能性有关。在分子水平上，它们是通过结合 microRNA、蛋白、调节 RNA 聚合酶 II(PolII)转录、干扰 pre-mRNA 加工等方式参与基因表达。此外，一些内源性环状 RNA 是可翻译的，其他一些则可以作为假基因衍生的来源。尽管有这些令人鼓舞的进展，但值得注意的是，环形构象和与线性 mRNA 的序列重叠使得对环状 RNA 的表达和功能的精确评估具有挑战性。

正文

1、circRNA 表达的复杂性：

circRNA 表达水平比其线性转录本表达水平低，具有细胞和组织特异性。所以保守性较差，在人和小鼠中只能观察到 10%-20% 的 circRNA。主要是由于顺式 ICSs 在环状 RNA 形成的外显子在环状 RNA 形成中的主要作用。反向剪接通常需要 ICSs 位于环状外显子两侧的内含子中。

例如 GCN1L1 基因，对应的 circGCN1L1 只在人里能检测到，因为小鼠对应的没有 ICSs ，即使人和小鼠该基因的外显子序列是保守的：

A 图：circRNA 的反向剪接
B 图：ICSs 对于 circRNA 的形成作用
C 图：2 种反向可变剪接模式和 circRNA 的 4 种可变剪接

一个基因位点可以产生多个环状 RNA，因为 circRNA 有两种反向可变剪接模式：5'反向剪接和 3'反向剪接，这样就产生了两种 circRNA。例如 DNMT3B 基因和 XPO1 基因属于这种模式。

此外 circRNA 还具有经典的可变剪接模式，分为：cassette exon，intron retention，alternative 5' splicing，和 alternative 3' splicing 4 种。CAMSAP1 基因就属于intron retention，XPO1 基因属于cassette exon。

2、circRNA 生物发生调控：

根据更广泛的定义，反向剪接环化是一种附加类型的选择性剪接。最近的数据表明，反向剪接需要剪接体机制和调控环状 RNA 的形成同时依赖于顺式调节元件和反式作用因子。尽管有普遍的共性，新出现的证据线已经确定了环状 RNA 形成的独特特征。一般来说，细胞中稳态环状 RNA 的表达水平可以在三个水平上进行调控：

1、对 circRNA 生物发生的调控始于 Pol II 对环状 RNA 产生的前 mRNA 的转录相结合。
2、顺式和反式调节因子影响剪接体机制催化的后剪接的效率。这些因素包括 ICSs 侧翼环形成外显子、核心剪接体成分和其他调控的 RBPs。
3、circRNA 周转也在其表达水平中起作用。

A 图：circRNA 3 个水平的调控
B 图：ICSs 位点的竞争导致产生多种 circRNA

3、与 Pol II 转录的耦合：

已知 Pol II 转录和前 mRNA 加工是紧密耦合的，转录延伸率是决定剪接事件结果的重要因素。最近的一项研究开始通过使用新反式的代谢标记：4-硫脲嘧啶(4sU)标记 RNA，来揭示亲本基因转录延伸、前 mRNA 剪接和单个基因位点的环状 cRNA 反向剪接之间的联系，定量测量人类细胞内的环状 RNA 加工动力学。

环状 RNA 形成的外显子的反向剪接可以同时在转录后和转录后发生时。一方面，一些大量表达的新生环状 RNA 形成事件与 Pol II 转录同时被检测到。有趣的是，研究还发现，新生的环状 RNA 产生基因的平均 Pol II 转录延伸率(TER)高于非环状 RNA 基因。与选择性剪接类似，TER 相对适度的增加或减少对环状 RNA 的形成有可测量的影响。因为反向剪接是通过内含子之间的 RNA 配对来促进的。这种正相关表明，快速延伸可能允许内含子间（而不是内含子内）的非序列互补序列配对，促进反向剪接。也有可能亲本基因 TER 通过干扰不同内含子对间假定 RNA 对的竞争来影响选择性反向剪接的选择。

另一方面，相当一部分新生的环状 RNA 只有在其宿主前 mRNA 转录完成后才被检测到，表明环状 RNA 的环化可能发生在转录后。

4、利用核心剪接体机制调控环状 RNA 的生物发生：

细胞如何调节从一个基因位点表达的环状和线性 RNA 的相对数量？利用基于黑腹果蝇漆酶 2 基因的微基因表达质粒，结合 RNAi 筛选，最近的一项研究发现，许多核心剪接体成分的缺失，包括 SF3b 和 SF3a 复合物，导致了首选的环状 RNA 表达。这表明，在剪接体缺失的条件下，通过消耗剪接体的缺失或化学抑制剪接体的活性，可以从典型的剪接向反向剪接的转变。除了核心剪接体因子外，在人类细胞中，全基因组 siRNA 筛选已经确定，环状 RNA 的表达需要一系列的剪接调控因子。

5、通过顺式元件调控环状 RNA 的生物发生：

一般来说，除了 ss 之外，循环化并不需要特定的外显子基序，但大多数内源性的人类环状 RNA 由几个外显子组成，通常是两个或三个。反向剪接通常需要位于环状外显子两侧的内含子中的调控元件。哺乳动物中的大多数环状 RNA 和蠕虫，由具有长侧翼内含子的内外显子加工而成，通常包含 ICS。在反向剪接外显子侧面的内含子之间形成的 RNA 配对 可以使远端 ss 接近，以促进环状 RNA 的生物发生。相应地，通过对环状 RNA 表达载体的突变分析显示，消除 RNA 配对会显著减少，有时甚至去除环状 RNA 的产生。

短重复序列(30到40nt)足以在表达载体中诱导环状 RNA 的形成。RNA 配对可以在多个水平上调节环状 RNA 的动态表达。在侧翼内含子之间形成的 RNA 配对通常会增强环状 RNA 的形成。此外，单个内含子内的RNA配对通常会促进线性 RNA 的典型剪接，与侧翼内含子间的 RNA 配对竞争，导致来自同一基因位点环状 RNA 的形成减少。此外，在不同环状 RNA 形成外显子两侧不同的内含子集合上可以形成多个 RNA 对。这些假定的 RNA 对在不同序列之间的竞争侧翼内含子可以导致来自同一基因的选择性反向剪接。

值得注意的是，由于重复元件在哺乳动物的进化过程中优先富集，在低等生物中侧翼内含子互补性可能不是环状 RNA 的关键特征，如黑腹果蝇和水稻。然而，果蝇中绝大多数环状 rna 的形成似乎不是由侧翼 ICS 驱动的。此外，当插入的侧翼内含子区域长度短至20nt或没有反向重复时，在人类细胞的表达载体中也检测到环状 RNA。这表明可能存在环状RNA生物发生的其他机制或调控元件。

6、RBPs 调控环状 RNA 的生物发生：

双链RBP(dsRBPs)可以通过结合并可能稳定反向剪接，通过环状形成外显子，促进环状 RNA 的产生。免疫因子NF90和/或NF110各包含两个 dsRNA 结合域(dsRBDs)，通常通过直接结合新生 pre-mRNA 形成的IRAlus来促进环状 RNA 的形成。在内源性 NF90 敲除条件下，重新引入野生型 NF90，而不是具有 dsRBD 截断的 NF90 突变体，挽救了 circRNA 的表达，进一步支持了 NF90 的两个 dsRBDs 是环状 RNA 产生所需的。然而，dsRBDs 也可以通过破坏RNA配对来抑制环状RNA的形成。作用于 RNA 的腺苷脱氨酶1(ADAR1)通过对环状外显子侧翼的 RNA 对的A-to-I编辑来抑制 circRNA 的表达，这降低了这些 RNA 对的互补性和稳定性。

没有 dsRBD 结构域的 RBP 也可以通过直接与特定的RNA基序结合来参与环状 RNA 水平的调控。例如，许多环状 RNA 在人类 EMT 过程中通过剪接因子(QKI)表达上调，后者缺乏 dsRBD。QKI 被发现通过与其一致靶向环状 RNA 形成外显子两侧的内含子中的单链 RNA(ssRNA)基序。因此，将合成的 QKI 结合位点插入到内含子中就足以产生环状 RNA。由于 QKI 形成二聚体，我们认为 QKI 可以通过二聚体使环状外显子更近地结合在一起，从而增强环状 RNA 的形成。

总之，这些最近的发现表明，环状 RNA 的产生高度依赖于生物环境，并在细胞中使用不同的顺式元件和反式因子进行严格调控用于反向剪接。

7、环状 RNA 的周转：

环状 RNA 被推测是稳定的，因为它们的环状结构可以抵抗大多数 RNA 衰变机制的降解。虽然反向剪接效率低效，但一些环状 RNA 可以在转录后累积到较高水平。例如，检测的 PA1 细胞中的环状 RNA 在 16 小时内逐渐积累，而它们相应的线性转录本的平均半衰期为 8 小时。另一项研究表明，乳腺细胞中 60 个环状 RNA 的半衰期为18.8-23.7小时，而相应的线性转录本的半衰期为4.0-7.4小时。在有丝分裂周期相似的细胞中，环状 rna 的稳态水平与其新生水平呈正相关，表明在细胞中，检测细胞和/或组织特异性的稳态环状 RNA 的方式可能会重新影响内源性环状 RNA 的合成：产生的新生环状 RNA 越多，检测到的环状 RNA 的稳态水平就越高。有趣的是，在分裂速率缓慢的细胞中，如神经元和衰老的神经元组织中，高表达的环状RNA是由一些主要基因产生的 RNA 亚型。

环状 RNA 最终如何降解尚不清楚。一种假说是，内切酶可能启动环状 RNA 的裂解，但这种酶尚未被确定。另外，由 miRNA 结合的环状 RNA 可能通过 ago2 介导的裂解来启动环状 RNA 的降解。最后，最近有研究表明，N6-甲基腺苷(m6A)是发生在腺苷碱基上的最丰富的内部 RNA 修饰之一，广泛分布在环状 RNA 上，m6a 修饰的环状 RNA 经常来自于 mRNA 中未甲基化的外显子，而在组成 m6a 环状 RNA 的同一外显子上甲基化的 mRNA 表现出较少的稳定性，表明 m6a 环状 RNA 与其相应的线性 mRNA 稳定性之间存在联系。然而，m6a 修饰是否会影响环状 RNA 的稳定性尚不清楚。未来的研究需要揭示环状 RNA 周转的机制。

8、环状 RNA 在生理和病理条件中的新出现的作用：

环状 RNA 优先从神经基因中反向剪接，并在哺乳动物大脑中积累到高水平及果蝇的衰老神经组织。许多环状 RNA 在神经发生过程中也表达上调，并且在突触发生中相比于它们的线性异构体显著富集。

环状 RNA 也与癌症的发展有关，例如在 EMT 转化过程中。环状 RNA 与先天免疫反应相关，例如在病毒感染过程中。环状 RNA 也和人类疾病相关。

9、环状 RNA 的加工自然影响其线性同源物的剪接：

因为大多数环状 RNA 来源于蛋白质编码基因的中间外显子，环状 RNA 的加工过程可以影响其前体转录本的剪接，导致基因表达结果的改变：

虽然反向剪接不如正常剪接有利，但已经有研究表明，在环状 RNA 生物发生中使用 5'和 3' ss 可以与前 mRNA 的剪接竞争，导致降低外显子的线性 mRNA 水平。一般来说，外显子环化越多，加工的 mRNA 中就越少。然而，并不是所有跳过的外显子都能产生环状 RNA ，这表明额外的调控因子可能影响外显子环化或线性亚型的跳过。

10、核保留的环状 RNA 可以调节转录和剪接：

虽然大多数环状RNA位于细胞质中，由加工过的套索内含子(ciRNAs)产生的环状 RNA 或与内含子保留(EIciRNAs)的反向剪接的环状 RNA，都限制在人类细胞的细胞核中。核保留的环状 RNA 被发现参与了转录调控。敲除一些 EIciRNAs 可以减少其亲本基因的转录，EIciRNAs 可以与U1snRNPs(U1小核核糖核蛋白)相互作用，而EIciRNA-U1snRNP 复合物在其亲本基因的启动子上与 Pol II 结合，以增强基因表达。

CircSEP3 是来自拟南芥中 SEPALLATA3(SEP3)第 6 外显子的核保留 CircRNA，据报道调控其线性对应物同源 MADSbo 的剪接。CircSEP3 与其同源 DNA 位点强烈结合，形成一个RNA：DNA 杂交，而具有相同序列的线性 RNA 与 DNA 的结合要弱得多。据推测，这种环状 RNA：DNA 的形成导致转录暂停，导致具有外显子跳跃的选择性剪接的 SEP3mRNA 的形成。

11、环状 RNA 可以作为 miRNA 海绵：

有人提出，相互竞争的内源性RNA(ceRNAs)可以通过其结合位点作为 miRNA 的海绵，而来自单个基因的 ceRNA 丰度的变化可以调节 miRNA 对其他靶基因的活性。最近的研究表明，一些丰富的环状 RNA 可以作为 miRNA 海绵发挥作用。

12、环状 RNA 可以通过相关蛋白发挥作用：

环状 RNA 可以与不同的蛋白质相互作用，形成特定的 circRNPs，随后影响相关蛋白的作用模式。例如多功能蛋白 MBL 可以促进由同一基因位点产生的 circMbl 的生物发生。

13、环状 RNA 可以翻译：

反向剪接产生的绝大多数注释的环状 RNA 主要位于细胞质中，产生了一个有趣的问题，即它们是否被可翻译？

线性 mRNA 的翻译通常需要一个 5'端 7-甲基鸟苷(m7G)帽结构和一个 3'poly(a)尾巴。由于环状 RNA 既缺乏帽和 poly(A)尾巴，有人提出翻译环状 RNA 应该以帽独立的方式发生。实现环状 RNA 翻译的一种方法是通过作为内部核糖体进入位点(IRESs)的序列来促进起始因子或核糖体与可翻译的环状 RNA 的直接结合。工程化的环状 RNA 在含有 IRESs 时可以表达蛋白质。虽然有报道称大多数内源性环状 RNA 与核糖体的翻译无关，但最近的三项研究表明，内源的一小部分环状 RNA 是可翻译的。

14、环状 RNA 作为生物标志物：

固有的环状特征使环状 RNA 在细胞内和细胞外血浆，包括血液和唾液。环状 RNA 也被报道通过外泌体从细胞体运输到细胞外液。虽然环状 RNA 是否能调节遥远组织和细胞的基因表达仍有待确定，但循环环状 RNA 的存在表明，疾病相关的环状 RNA 是很有前途的诊断生物标志物。

15、目前对环状 RNA 的研究方法：

环状 RNA 的全基因组注释：

环状 rna 的全基因组注释，包括：total RNA-seq、 rRNA-depleted total RNAs (ribo- RNA-seq)、 rRNA-depleted and non-poly(A) RNAs(p(A)- RNA-seq)、circRNA-enriched RNAs by RNase R, which digests linear RNAs and preserves circular RNAs(ribo- and RNase R or p(A)- and RNase R RNA-seq)。后者效果是最好的。

由于环状 RNA 序列几乎与同源线性 RNA 完全重叠，全基因组检测主要依赖于唯一映射到反向剪接的 RNA-seq reads 的识别连接处(BSJs)。许多算法已经被开发出来来全局检测来自不同 RNA-seq 数据集的 circRNA 表达。这些算法很大程度上依赖于映射独特的 bsj 来定位环状 RNA。值得注意的是，由于使用了各种策略，在算法之间观察到不同的环状 RNA 预测结果用于反向剪接预测。差异也可以来自于检测样本中大多数环状 RNA 的低表达和映射到 bsjs 的 RNA-seq reads 的低覆盖率。因此，环状 RNA 注释应该谨慎处理，并应该结合几种算法，以实现可靠的预测。

环状 RNA 的实验验证

QPCR、NB：

考虑到现有计算方法的高假阳性率，需要采用实验方法来验证计算预测的结果并进行选择高可信度的环状 RNA 有待进一步研究。一种简单的方法是使用不同的 PCR 来扩增推测的 BSJ 位点，然后进行 Sanger 测序来确认这些位点：

敲低：

功能缺失(LOF)和功能获得(GOF）通常用于注释基因的功能。RNAi 和 CRISPR/cas9介导的基因组编辑来降低环状 RNA 的表达。

敲除：

过表达：

展望

环状 RNA 的动态表达模式、复杂的调控网络以及在多个细胞水平上的新兴作用共同表明，它们不仅仅是异常剪接的副产物，而且是新兴的调控 RNA 分子。尽管我们最近对环状 RNA 的生物发生和功能的理解取得了这些进展，但关于它们的转录后调控仍存在许多问题有待探索。例如，我们缺乏对它们最终是如何降解的，以及它们的结构如何赋予与线性 RNA 的功能差异的理解。作为外显子调控 RNA 的定位和功能往往在一定程度上是耦合和协调的，对环状 RNA 的生物发生和调控的深入注释无疑将提高我们对它们的理解功能。此外，未来对神经系统、癌症发育、先天免疫反应和其他生物环境和疾病中的环状 RNA 的研究将进一步揭示环状 RNA 的秘密.在不影响 RNA 常驻基因的情况下研究这些环状 RNA 的方法的改进将是理解它们在细胞中功能的关键。

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