经纬行研 | 基因治疗：如何发现、改造“神的密码”。
基因疗法，也叫基因治疗（gene therapy）是指利用分子生物学手段，将核酸导入患者体内，使其表达基因产物（如蛋白质），或对患者基因进行编辑，从而达到治疗疾病的目的。过去的几年中，基因治疗对遗传疾病和癌症表现出惊人的功效，使得产业界、投资界和社会公众对基因治疗又有了更多的期待，在7月就有多家基因治疗公司获得融资。
和元生物
7月7日，细胞及基因治疗药物研发商和元生物宣布完成约2亿元Pre-C轮融资，由倚锋资本领投，正心谷创新资本、浦东科创、张江科投、金浦投资、盛山资产等多家投资机构参与。
2020.07安龙生物
7月8日，基因治疗技术研发商安龙生物完成A轮4000万人民币融资，投资方为盈科资本。
2020.07Encoded Therapeutics
7月22日，致力于开发精准基因疗法的Encoded Therapeutics公司宣布完成数额为1.35亿美元的D轮融资。投资者包括GV（前谷歌风投），Matrix Capital Management和ARCH Venture Partners。
近日，我国基因治疗领域专家、上海交通大学蔡宇伽教授对我国基因疗法的发展做了详细概述，并在Nature子刊上发文，题目为“An overview of development in gene therapeutics in China”。下面我们就来对基因治疗这项技术做一个梳理。[1]
由来已久的基因疗法
实际上，基因治疗的最早尝试可追溯到1970年的一场未经批准的临床治疗，当时美国医生斯坦利·科恩（Stanley Cohen）试图通过注射含有精氨酸酶的乳头瘤病毒来治疗一对姐妹的精氨酸血症，该尝试以失败告终。
随后科学家们试图通过引入正常基因组替换突变基因组的方式，达到治疗目的。但在基因疗法的早期阶段，一直没有出现将外源基因传递给人类细胞的有效工具。直到20世纪80年代末，病毒载体兴起。相应的公共监管体制也在那时候建立起来，并在90年代起正式批准基因疗法用于人体临床试验。
1990年，美国国家食品药品监督管理局正式批准了第一个基因治疗临床试验，美国国立卫生研究院进行了世界上首次人体基因治疗的临床试验。一名年仅4岁患有先天性腺苷脱氨酶缺乏症的小女孩，经过基因治疗技术导入正常的腺苷脱氨酶基因，患儿的免疫能力得以提高，获得了明显的治疗效果。这项临床试验的成功成为当今生物医学发展最重要的篇章。此后，世界各国都掀起了基因治疗的研究热潮。
然而，在1999年，美国一位18岁少年Jesse Gelsinger进行了针对先天性鸟氨酸转甲酰酶缺陷症的基因疗法临床试验后，体内产生了严重的免疫反应，并于4天后去世。这名18岁少年成为了首名死于基因疗法临床试验的患者。基因疗法因此遭受重创，人们对基因治疗的热情骤然间降至冰点。
随后的2002年底到2003年，法国巴黎Necker儿童医院报道重症联合免疫缺陷综合征（SCID-X1）接受基因治疗的患者中，有2例出现了类白血病样症状。这次又一次引发了公众对基因治疗安全性危机的大讨论。从此，人们对基因治疗的期望跌到了低谷，基因治疗临床试验也因此受到了更严格的监管。
直到2012年，欧洲药品管理局（EMA）批准UniQure公司的基因治疗药物Glybera。尽管该药在2014年正式上市后，商业化道路上并不成功，于2017年退出市场，但它作为西方国家第一个基因治疗产品，彻底打开了基因疗法的大门。
在之后的几年中，几种基因治疗产品相继涌入市场。2016年，葛兰素史克（GSK）的Strimvelis在欧洲获批上市；2017年，诺华（Novartis）和吉利德（Gilead）分别在美国获批上市的CAR-T疗法Kymriah、Yescarta，以及Spark Therapeutics公司一款基于AAV载体的基因疗法药物Luxturna，等等。
国内基因疗法的发展布局
尽管基因疗法最初于国外被开发并展开研究，但从上图中不难发现，世界上首款基因治疗产品其实出现在中国。在基因疗法发展的历史长河上，中国早在1991年就对B型血友病患者展开了世界上第二次的基因治疗临床试验，并于2003年批准获得了世界上第一个基因治疗产品今又生（Gendicine）。随后在约20年的时间里，中国在基因疗法领域方面做出了不断的努力。
▲ 中国基因疗法的里程碑
就目前而言，我国针对基因疗法领域正在进行的临床试验多达20余项（如下图所示）；针对的适应症有A/B型血友病、β-地中海贫血、转移性非小细胞肺癌、食道癌、Leber遗传性视神经病变(LHON)、自身免疫性缺陷疾病以及各种实体瘤。
▲ 中国正在进行的基因治疗临床试验
随着基因疗法的布局和发展，运用于基因疗法的各类技术也得到了不断地提升，并实现了突破；与此同时，相应的监管机制和法规条款也在不断更新。
基因疗法技术的不断突破
目前，基因疗法领域最热门的技术可以说是AAV载体递送技术、CRISPR基因编辑技术、单/双碱基编辑技术以及溶瘤病毒基因改造技术等。
腺相关病毒(AAV)最早于在20世纪60年代中期从实验室腺病毒(AdV)制剂中发现，随后很快就在人体组织中被发现。它具有无致病性、高效的长期基因表达、易于基因操作以及免疫反应低(或在许多情况下缺乏)的特点，这一系列特性使其成为基因递送的重要工具。
▲重组AAV载体介导转基因表达的过程
目前，最新的AAV基因组设计能够将衣壳中携带的单链DNA设计成自我互补的序列。这种序列的优点在于它不需要单链DNA复制成为双链DNA的步骤就可以进行转录，与传统的单链AAV基因组相比，它的基因表达更为迅速，而且表达量更高。诺华公司开发的治疗脊髓性肌肉萎缩症（SMA）的Zolgensma就使用了这种基因组设计。然而这种设计的一个缺点是AAV携带的转基因容量减半，还需要进一步研究优化。
至今为止，全球已有三款以重组AAV为载体的基因治疗药物获批上市，除了诺华公司的Zolgensma（AAV9）以外，另外两款是UniQure公司开发的Glybera（AAV1）和SparkTherapeutics公司开发的Luxturna（AAV2）；另外还有一款治疗A型血友病的AAV基因治疗药物BMN-270（来自BioMarin）也提交了上市申请。由此我们可以看出AAV基因疗法的潜力是巨大的。
作为基因编辑工具，CRISPR已经成为生物医学领域的最热门技术。早在20世纪下半叶，CRISPR序列就已经被科研人员发现并记录 ，直到2002年，这些序列正式被命名为：规律间隔成簇短回文重复序列（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats, CRISPR）。
▲ CRISPR技术发展时间轴（图片来源：Nature）
2012年8月，Doudna与Charpentier两个团队合作在Science杂志发表了关于利用CRISPR/Cas系统在体外对DNA进行精确切割的具有开拓性的研究论文：他们可以使用这种CRISPR/Cas9系统在任何想要的地方切割任何基因组。
随后，取得进一步进展的是麻省理工学院(MIT)和哈佛大学的Broad研究所的华人学者张峰，其研究组于2013年2月刊登的一篇论文表明：CRISPR/Cas9可用于编辑小鼠细胞或人类癌细胞的基因组。在同一期的Science期刊上，哈佛大学的George Church和他的团队展示了如何使用CRISPR技术来编辑不同的人体细胞，包括正常人的iPS细胞。
从那时起，研究人员发现CRISPR/Cas9的功能非常多样。科学家不仅可以使用CRISPR通过剪断基因来“沉默”基因，还可以利用修复模板将剪切片段留下的缝隙替换为所需的基因。
随后，科学家们对CRISPR技术进行了多方面的改进研究，截止2017年，关于CRISPR的论文，就已经有超过14,000篇。目前，该技术发展的相当成熟，已经广泛运用于基因疗法领域，有望帮助各类遗传性基因疾病患者获得新的治疗途径。
现有的基因编辑技术，例如CRISPR、ZFN、TALEN，通过在DNA中产生靶向的双链断裂，然后依靠细胞自身修复机制来完成编辑过程；这些方法可以有效地改变基因表达。然而，它们缺乏对编辑结果的控制，脱靶效应以及对DNA双链断裂的依赖，可能导致基因编辑后的细胞出现不可预期的混乱。许多基因组突变发生在单个碱基中，为使基因编辑更加精确，单碱基基因编辑技术应运而生，旨在针对这些单一的碱基错误(即点突变)，而不会在DNA中造成双链断裂。
2016年4月，David Liu教授团队在Nature上发表的论文表示，首次开发出了胞嘧啶碱基编辑器（CBE），能够在不依赖DNA双链断裂的情况下首次实现了对单个碱基的定向修改。这便开启了CRISPR系统的单基因编辑时代。随后，David Liu教授团队又开发了另一种单碱基基因编辑工具——腺嘌呤碱基编辑器（ABE），从此研究人员首次实现了不依赖于DNA断裂而能够将DNA四种碱基A、T、G、C进行替换的单碱基基因编辑技术。
但科学家们在随后的研究过程中发现，单碱基编辑系统存在严重的脱靶效应，同时会诱导大量基因突变，另外还存在着编辑窗口单一、编辑转化效率不高等缺点，故而对其展开了一系列的优化改善研究；2019年10月，David Liu团队再次开发出先导编辑器(Prime Editor, PE)，一种能够搜索和替换（碱基）的基因编辑器，在不依赖DSB和供体DNA的条件下便可有效实现所有12种碱基转换（C→T、G→A、A→G、T→C、C→A、C→G、G→C、G→T、A→C、A→T、T→A和T→G），此外还能有效实现多碱基的精准插入。
2020年6月，国内邦耀生物与华东师范大学刘明耀教授及李大力教授团队合作的一项研究表明，将胞嘧啶脱氨酶hAID-腺嘌呤脱氨酶-Cas9n（SpCas9 D10A突变体）融合在一起，开发出的一种新型双功能碱基编辑器-命名为：A&C-BEmax，不仅可以实现单独的C>T或A>G，还可以在同一等位基因上同时实现C>T和A>G的高效转换。双碱基基因编辑技术的出现极大地丰富了碱基编辑工具、扩展了碱基编辑器的应用范围，为遗传病治疗、作物育种等于带来新的发展，可以说是人类在基因编辑领域新的突破。
▲ 溶瘤病毒发展史
溶瘤病毒疗法最初发现于20世纪初期，活跃于20世纪中期的大量临床试验，但由于当时技术有限，主要都是利用天然的溶瘤病毒，其引发的强烈免疫反应和并发症导致效果不佳、副作用大，使得当时化疗和放疗显示出了颠覆性的疗效，故而该领域受到冷落。
后来，随着病毒学和基因工程技术的不断发展，使得人们能对病毒基因进行改造，这大大提高了溶瘤病毒在肿瘤治疗方面的效果、特异性和安全性。之后，溶瘤病毒就开启了肿瘤治疗的新纪元——溶瘤病毒疗法。
随着重组病毒基因组改造技术的逐渐成熟，溶瘤病毒疗法技术已广泛运用于实践。其里程碑事件，是2015年美国FDA和欧盟批准溶瘤病毒T-Vec上市；目前T-Vec已在美国、欧洲和澳大利亚广泛用于复发黑色素瘤治疗。近几年，该领域似乎重新回归到大家的视野中，成为国内外基因疗法研发领域的星星之火，值得期待。
基因疗法监管机制的发展
基因治疗监管政策于1993年首次出台，由国家科学技术委员会颁布的“基因工程安全管理措施”为起步进行推行。随后在不断发展中，21世纪初，中国形成了相对全面但仍然宽松的基因治疗监管政策，涉及药物临床试验、基因治疗质量控制、辅助生殖、伦理审查、干细胞等多方面管控。
2010年，国家食品药品监督管理局发布了《药品临床试验伦理审查指导原则》。2015年，国家食品药品监督管理局与国家卫生和计划生育委员会联合发布了监管措施和道德准则，例如干细胞临床研究管理措施（试行），质量控制和治疗指导原则。同年，国家卫计委取消了对第三类医疗技术临床应用的行政审批，因此细胞疗法和基因疗法可以由医疗机构自行批准。
但在2016年，我国发生了关于生物免疫疗法的“魏则西事件”之后，国家卫计委立即暂停了所有未经批准的第三类医疗技术的临床应用，并且对基因治疗领域采取了更严格的监管政策。
尽管如此，基因疗法作为一种新的生物医疗技术和医学产业，仍然属于国家重点发展的领域。随后，国务院在“十三五”国家战略性新兴产业发展规划（国发[2016] 67号）中，对基因治疗领域的产业发展制定了激励政策。但是当时，中国尚未就人类基因技术问题（包括基因治疗）形成一套全面而系统的法律法规体系。
2018年，受贺建奎的“CRISPR基因编辑婴儿事件”影响，中国开始加强生物安全，基因技术和生物医学等领域的立法。2019年，《生物安全法》通过了全国人民代表大会常务委员会的第一次审查。该法律的目标是成为生物安全的基础、系统、全面和主导的基本法。
2019年，在中央全面深化改革第九次会议上，审议通过了《国家科技伦理委员会组建方案》，目的是建立全面覆盖、秩序协调、标准化的综合科学技术伦理治理体系。目前，国家卫计委正在采取相应的立法行动，并起草了《生物医学新技术临床应用管理条例》（征求意见稿）》和《生物技术研究开发安全管理条例（征求意见稿）》，目标是形成更加合理的监督机制，以便生物技术研发、应用和相关产业健康发展。
由此，我国基本形成了与基因疗法技术以及行业发展相适应相协调的全面监管政策。
展望
近年来，我国基因疗法领域正在逐步兴起。作为一种新的医学领域，它正在深刻地改变着制药业的面貌，但还并未发展成熟，对此人类还需要进行更长时间的探索和发现。
尽管如此，这并不可怕。“泡泡男孩”的基因疗法事件告诫我们，相比于恐惧，在学习中探索未知，才会使基因疗法领域得到蓬勃发展，才能使得更多患者获得生的希望。
因此，公众对该领域的认可、国家社会对该领域的支持、相关法律法规的建树，都将会成为该领域新疗法诞生的关键推力。
参考资料：
1.An overview of development in gene therapeutics in China
来源 | 医麦客
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编辑：彭庶文
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