柳暗花明又一村：siRNA药物的诞生之路（上）

引 言

2020年12月，诺华宣布其siRNA疗法Inclisiran(Leqvio®)已获得欧盟委员会的批准，用于治疗成人高胆固醇血症及混合型血脂异常，这是一款“first in class”产品，患者在首次及第三个月接受初始治疗后，每年仅需注射两次，即可控制LDL-C水平，可解决患者长期用药依从性问题，这款产品的上市将siRNA药物进一步推上了生物制药领域研发风口。本文将讨论siRNA研究的发展历史、研发进展及产业展望。

遗传信息在细胞内生物大分子之间进行转移，根据中心法则，遗传信息从DNA传递给RNA，再从RNA传递给蛋白质，即完成遗传信息的转录和翻译过程，部分病毒通过RNA的自我复制实现遗传信息传递，RNA是遗传信息传递重要载体。RNA由核糖核苷酸经磷酸二酯键缩合而成长链状分子，以DNA的一条链为模板，以碱基互补配对原则，转录形成一条单链。目前生物体内发现RNA有数十种，包括mRNA、tRNA、rRNA、siRNA、saRNA等。鉴于其在生命活动中发挥的重要作用，以及不同种类作用机制的揭示，针对RNA疗法的研究日益趋增，小干扰RNA(siRNA，small interfering RNA/short interfering RNA)即为靶向RNA疗法重要领域。

1990年：Jorgensen等在研究矮牵牛花颜色时发现RNA干扰现象，当时其被命名为基因的共抑制现象。1998年：RNAi效应发展的里程碑，美国斯坦福大学的Andrew Z .Fier和美国马萨诸塞大学的Craig C .Mell首次证明在正义RNA阻断基因表达的试验中，真正起作用的是双链RNA。这些双链RNA是体外转录正义RNA时生成的，将双链RNA注入秀丽线虫，诱发了比单独注射正义RNA和单独注射反义RNA都更强的基因沉默，他们将这种由dsRNA引发的特定基因表达受抑制的现象称为RNA干扰。1999年：Tusch等报道在哺乳动物中也存在RNAi，只是导入的RNA是小干扰RNA。2001年：Berstein等提出，只有22nt核苷酸才能特异性地阻断dsRNA，同时他们还发现了体内一个分解dsRNA为siRNA的Dicer酶。2004年：第一个以siRNA为基础的RNA（治疗湿性年龄相关性黄斑变性）药物进入I期临床试验。2006年：Andrew Z .Fier及Craig C .Mell因RNAi突破性的发现获得诺贝尔生理或医学奖。

由于RNAi可特异性地沉默内源或外源性靶基因，因此理论上人们只要知道了疾病的致病基因，就可以针对该基因的mRNA设计出相应的siRNA，借助RNAi效应使该疾病的基因表达沉默，从而达到治疗疾病的目的。可以认为，应用RNAi技术理论上可以治疗几乎所有类型的疾病，基因治疗将变得更加精准且可定制。自1998年RNAi的机理被揭示之后，RNAi药物经历了30年的浮沉，三十年来既有蜂拥而上的研发热潮，也有未达临床预期的沉寂。

近年来，随着基因测序及靶向载体递送系统的完善，RNAi在生物医药中的应用已经取得了一些重要的进展，siRNA药物的研发也进入了新的稳步发展阶段，根据Grand View Research发布的报告，2018-2025年，全球反义寡核苷酸和RNAi治疗药物市场规模预计将以8.6%的复合年增长率（CAGR）增长，预计在2025年将达到18.1亿美元。

一、siRNA基础结构及作用机制

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基础结构

siRNA是经过dsRNA切割形成20-25nt的双链RNA分子，其特征性结构为每条单链上都具有5'末端磷酸基及3'末端羟基和2-3个突出的非配对碱基，结构特点十分鲜明，任一碱基的错配均会导致RNAi效应的丧失。

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 RNAi作用机理

在RNAi引起基因沉默的过程中，细胞内具有核糖核酸酶Ⅲ（ribonuclease Ⅲ，RNase Ⅲ）活性的核酸酶Dicer首先识别双链RNA（dsRNA）或发卡RNA（hairpin-RNA），将其切割成siRNA，随后siRNA与无活性的RNA诱导沉默复合物（RNA induced silencing complex，RISC）结合，在解螺旋酶的作用下siRNA双链解开为单链。由于siRNA与mRNA具有高度同源性，其反义链通过与靶基因mRNA进行特异性结合使RISC活化，最后RISC中的Argonaute蛋白将靶基因mRNA剪断，实现基因表达沉默。由于siRNA的反义链在RNAi系统导致的序列特异性基因沉默中作为模板，这条链也被称为引导链或指导链（guide strand），相应的正义链被称为随从链（passenger strand）。

与此同时，内源性微小RNA（或miRNA）也可以通过RNAi系统导致基因沉默。miRNA的生物起源最初是在细胞核内启动，miRNA利用RNA聚合酶Ⅱ或Ⅲ被转录形成初始miRNA（primary miRNA，pri-miRNA），pri-miRNA转录本含有5'帽子结构和3'-poly A尾序列。典型的primiRNA带有一个含33nt碱基的茎环结构。随后Drosha-DGCR8复合物将pri-miRNA加工成约70nt的前体miRNA（precursor miRNA，pre-miRNA）。

Drosha是一种细胞核RNase Ⅲ，可以与DGCR8（DiGeorge syndrome critical region gene-8）形成复合物，加工底物形成5'含磷酸基团、3'有2个悬挂碱基（2-nt overhang）的RNA产物。接着，pre-miRNA被核转运受体复合物（exportin-5-RanGTP complex）转运进细胞质，随后这些70nt的pre-miRNA进一步被Dicer加工成约22nt的成熟miRNA。成熟miRNA随后被装载入RISC以产生基因沉默作用。miRNA通过部分匹配的方式与其靶mRNA识别，并结合在靶mRNA的3'非翻译区（3'-UTR），最后在P-body中miRISC切割其靶mRNA或抑制蛋白质翻译，从而完成RNAi过程。

siRNA及mRNA作用过程对比

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 siRNA药物的优势

可针对该基因的靶向mRNA设计出相应的siRNA，借助RNAi效应使该疾病的基因表达沉默，因此区别于传统化药、生物药，siRNA药物具有以下优势：

1）靶点丰富

siRNA药物靶点为靶向mRNA，间接调控各类蛋白的表达，能从转录水平进行治疗，针对于一些尚无突破的蛋白靶点，siRNA药物提供了新的希望。

2）特异性强

siRNA通常是一段21nt的核酸序列，从统计学上说，21nt的序列重复出现的可能性极低。RNAi属于转录后基因沉默，有高度的序列特异性，siRNA是严格按照碱基互补配对原则与靶mRNA结合的，因此只降解同源的mRNA，由于其高特异性，不会降解与目的mRNA非同源的其他mRNA，从而实现只针对目的基因的精确沉默。

3）级联放大效应

经过切割后新产生的siRNA片段又可作为引物在RNA依赖的RNA聚合酶的作用下，以mRNA为模板重新合成新的dsRNA，再次与Dicer酶结合形成RISC复合体，介导下一轮的同源mRNA的降解，如此循环，可以使大量的同源mRNA降解，从而产生级联放大效应，显著增强对基因表达的抑制作用。

4）研发周期短、针对性强

siRNA需要进行严格的程序设计，根据基因测序得到的靶向序列，针对疾病基因进行特异性的设计。故整个设计流程针对性极强，能够快速、高通量地开展分析，缩短药物的筛选过程，大大节省了盲目开发的时间。

但是，任何事物都有双面性，双链siRNA片段有以下特点：分子量大、分子本身不稳定、亲水性强、带负电荷、没有靶向机体内组织及细胞膜上受体的能力、对机体来说属于外源大分子物质，与此同时，细胞膜本身是带负电荷的磷脂双分子层，从而使得siRNA分子在成药方面存在以下5个问题：

1）siRNA分子无法穿过细胞膜，只能通过很有限的胞饮作用形成内涵体进入细胞，这个过程本身效率很低；2）通过胞饮作用形成内涵体进入细胞的siRNA分子没有有效的从内涵体中逃逸的途径，大部分会在溶酶体中被水解，也无法发挥作用；3）siRNA分子分布特性差，无法特异性地富集在靶组织或靶器官中，对于靶组织或靶器官的治疗效果会大打折扣；4）siRNA分子在血液中半衰期极短，易被普遍存在于人体中的核酸酶降解，也易被肾脏和肝脏滤过排出；5）机体被注入外源性siRNA会激活免疫系统，引起干扰素反应等副作用。

目前解决上述问题的方法有两种：

其一：通过对siRNA进行化学修饰，来提高siRNA分子的稳定性，增加靶标结合亲和力，降低免疫原性，减少肾脏过滤排出；其二：更加有效的方式是使用通过使用精心设计的递送系统，例如将siRNA分子连接靶向配体（比如N-乙酰半乳糖胺(N-acetylgalactosamine，GalNAc)）或包裹在脂质纳米粒中，如此可以很好地保护siRNA分子，增强靶向性，增加细胞摄取，提高siRNA从内涵体中逃逸的速度。

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siRNA的化学修饰

siRNA的体内稳定性差，易被RNA酶降解，且存在免疫原性等缺点，我们通过化学修饰可以增强裸露的siRNA的稳定性，同时不会影响沉默靶基因。siRNA结构为1分子磷酸+1分子核糖+1分子含氮碱基，所以对应的化学修饰包括磷酸骨架修饰、糖环修饰和碱基修饰。

 RNA化学结构示意图

（1）siRNA磷酸骨架修饰

主要为磷硫酰修饰（PS），将固有的P=O键替换为P=S键，siRNA血浆稳定性增强。但同时，P=O键被P=S键替代后会出现细胞毒性。硼烷酸酯修饰（boranophosphate），将P=O键替换为P=B，能够比未修饰的siRNA的核糖核酸酶抵抗力增强10倍以上，同时对沉默效应无影响且无细胞毒性。肽核酸修饰（PNA），PNA修饰是将糖环-磷酸骨架换成多肽骨架。将PNA引入siRNA后会增强siRNA的血清稳定性和持续的活性，在正义链的3ʹ悬垂处进行PNA修饰，siRNA将表现出更强的活性以及持续时间。

siRNA磷酸骨架修饰示意图

（2）糖环修饰

糖环修饰是siRNA化学修饰中运用的最为广泛和成熟的方法，包括2ʹ-修饰（2ʹ-OMe，2ʹ-F，2ʹ-MOE，2ʹ-FANA，CE，EA），4ʹ-修饰（4ʹ-S，4ʹ-S-FANA），5ʹ-修饰（5ʹ-OMe），异构修饰（LNA，UNA，ALN，OXE，ENA，HNA，ANA，HM）以及这些修饰的组合修饰。LNA异构修饰通过糖-磷酸主链的核糖在2'-O和4'-C之间形成-O-CH2亚甲桥，从而“锁定”糖环的构象，使LNA与RNA特异结合的亲和力增强，这也是第三代化学修饰技术。最近研究显示在siRNA双链的核糖的2ʹ位置都引入LNA可延长其在血清的中的半衰期到90h，但对其基因沉默效应有相反的作用。这表明只能对siRNA的化学结构做适当的修饰。

（3）碱基修饰

siRNA碱基修饰是指在siRNA的碱基上进行化学修饰，主要分为嘌呤修饰，嘧啶修饰以及碱基替换三种形式。嘌呤修饰包括N6-甲基腺苷修饰（m6A）；嘧啶修饰包括3-甲基尿嘧啶核苷（m3U）、5-甲基尿嘧啶核苷（m5U）、假尿苷、硫尿核苷（s2U）、丙炔尿嘧啶核苷（5-pU）、二氢尿嘧啶核苷（D）等修饰；碱基替换包括AP，rF，rL等修饰。

虽然天然的siRNA具有极其强大的基因沉默功能，但是在临床运用中，由于细胞免疫反应，血清稳定性差等因素，化学修饰的siRNA比天然siRNA更为人们所运用。这些修饰手段为提高siRNA的血清稳定性，降低siRNA的脱靶效应，提高siRNA的特异性等方面提供了有效的解决方法。

目前，对于核酸的化学修饰经过了数十年的发展，已经发展出了3代技术。最常用的化学修饰是第一代的硫代磷酸酯和第二代的甲基膦酸酯。膦酸甲酯不带电，因此比天然DNA或RNA更具亲脂性，并且可以更好地穿透细胞。

但是，甲基膦酸酯的溶解度一直是个问题，常与膜结合，仅有较少修饰后小核酸能进入细胞质内。因此，后续又产生了第三代PNA、LNA等技术。但这些技术或多或少仍有潜在的肝毒性以及效率低下等问题，在真正运用中，序列不同的siRNA修饰后表现出来的现象可能会与预期的不一致。工业界与学界也意识到，化学修饰对于小核酸药物递送十分重要，但如靶向性等大量问题单纯依靠化学修饰还是难以解决，最终还是需要依靠递送系统。

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siRNA递送系统

目前siRNA的递送系统有病毒载体系统和非病毒载体系统。病毒载体包括逆转录病毒、慢病毒、腺病毒相关病毒等，其在体外转染效率高，体内实验中作用时间久，但是其存在很严重的安全问题，且目的基因容量小、制备复杂成本高、不能体内反复使用，在临床应用受到很大限制。非病毒基因传递系统能克服这些问题，使用非病毒载体在保持一定转染效率的同时，对其加以修饰，增加体内作用时间，就可以避开临床安全性障碍，现已开发出了脂质体、纳米粒子复合体等基因传递系统。

以下就常用的递送系统做简单介绍：

（1）脂质体递送系统

脂质体为磷脂双层构成的具有水相内核的脂质微囊，其可装载siRNA到靶细胞。脂质体与siRNA通过静电吸附作用形成无定形复合物，保护siRNA免受体内RNA酶降解。脂质体介导的siRNA递送是目前最为成熟的siRNA治疗方法，已有多个临床试验的报道，其中胆固醇与passenger链的3ʹ末端结合。这种方法已被用于肝脏基因沉默（例如ApolipoproteinB，Apob）。脂质体通过内吞作用将siRNA转运到靶细胞。脂质封装因为其生物相容性和温和的组装，只需要混合和孵育组成物，能使多个不同的核酸分子组装成复合体。

DOPC和DOPE是最广泛使用的中性脂质体，siRNA和DOPC孵育后的包封率高于65%，此外，研究表明这些复合物能够在体内介导siRNA沉默癌基因。脂质体复合物容易被细胞吸收，中性脂质体无毒，不会引起免疫反应，但转染效率较低。阳离子脂质体是由带正电的脂双层组成，能包裹带负电的核酸分子，只需要将脂质与siRNA简单地混合即可，其混合物带正电荷。其所带的正电荷能增加转染效率，但多聚阳离子在体内引起炎症反应及与带负电荷的血清蛋白之间发生相互反应，产生调理作用致使阳离子复合体被清除。

阳离子脂质体的优点是制备简单，能包裹大量的核酸分子，转染各类型的细胞，用途很广，首个获批的siRNA药物Patisiran就是使用了Arbutus的LNP技术，但脂质体载体的缺点是对肿瘤细胞缺乏特异性，转染效率不及病毒载体。最近，脂质体传递系统的新一轮工作是采用一些合成的类脂质体(“lipidoids”)，与siRNA形成复合体，将寡核苷酸传递到细胞内。

脂质-siRNA结合物示意图

（2）纳米颗粒聚合物

纳米粒子是一种很有发展前途的基因传递系统，它稳定、释放能够受到控制，能包裹大量的遗传物质一起传递，表面容易修饰以提高其稳定性、运输能力、靶向性及生物吸收。聚合物能生物降解，具有生物相容性而且无毒，非常适合构建体内基因传递体系。壳聚糖、环糊精、树枝状聚合物、聚乙烯亚胺、聚乙烯酸等都是倍受欢迎的基因传递系统的材料。

壳聚糖是天然的阳离子多聚糖，具有粘附性，能防止核酸降解。通过优化壳聚糖-siRNA纳米粒子导致基因沉默在小鼠的肺部试验中取得了成功。环糊精聚阳离子体是另一类高度无毒的聚合物复合体，能用于传递质粒和小分子药物。聚乙烯亚胺因其正电荷分布密集，能聚合siRNA，使其免受核糖核酸酶的降解，促进细胞摄取。

脂质纳米颗粒包裹核酸

（3）金属核纳米粒子

金属核氧化铁、铁钴、铁金、铁镍包被在糖衣层，或者用其它的高分子材料形成一个核-壳的结构。siRNA通过连接金属核纳米粒子外部分子如硫醇，葡聚糖、阳离子聚合物或生物素-链霉亲和素与其结合。这些粒子的核因使用不同的金属而被赋予不同的特性，可注射后用磁共振成像来研究其在生物组织中的分布，也可应用外部磁体使其定向分布到特异性组织。这些都是其它的传递系统所缺乏的，但是其体内的毒性可能会限制其应用。最近的应用研究表明，氧化铁纳米粒子被证明是体内非常有效的核酸传递体系。

（4）GalNAc递送系统

GalNAc-siRNA是糖类化合物与siRNA形成的单缀合物，将N-乙酰化的半乳糖胺(GalNAc)以三价态的方式共价缀合到不同序列的siRNA的正义链3′末端，形成多糖-siRNA单缀合物。GalNAc是唾液酸受体（ASGPR）的靶向性配体，其与肝脏表面细胞具有较高的亲和力及迅速内化能力，从而实现该类siRNA缀合物特异性结合膜蛋白进入胞内。

1971年，科学家通过缀合唾液酸铁蛋白向肝脏靶向递送了nonglycoprotiens，首次在临床上验证了“肝脏细胞靶向递送”的概念。上个世纪九十年代初期，多价半乳糖和GalNAc形成结构明确的DNA结合的配体缀合物得以被阐述。1999年Biessen实验室开发了用于ASO（反义核酸）递送的Tris-Galactoside，通过GalNAc成功让ASO的肝靶向提高了10倍。到21世纪初，我们现在看到的基于“GalNAc缀合”再借助“ASGPR胞吞”的递送系统开始成型，目前siRNA领域大热的Alnylam公司也首次将GalNAc技术推进到了临床产品。

GalNAc结构示意图

递送系统的发展史也是核酸药物发展历程的晴雨表，其中由脂质体介导的基因转染是基因治疗最早、也是应用最为广泛的非病毒转染策略之一。

中性脂质具有低毒性和低免疫原性等优点，但其对基因的负载能力及转染效率较低；阳离子脂质有更高的基因负载和转染能力，虽有较高的毒性，但可以通过聚乙二醇（PEG）化学修饰等手段改善。目前，基于脂质/脂质体修饰的RNAi技术已广泛应用于眼部疾病和肿瘤的治疗。其中，利用脂质或脂质体递送siRNA是RNAi技术在眼科应用中最常用的一种策略，约占到全部应用的38%；在局部递送siRNA治疗肿瘤的研究中，选择脂质或脂质体/siRNA复合物的比例多达25%。纳米颗粒聚合物载体具有较好的生物相容性和较少的体内毒性，它与siRNA结合除了通过静电吸附外还可通过氢键、疏水作用力因此具有较高的稳定性，缺点是转染效率较低。金属纳米粒子载体带正电更容易与细胞膜结合，同时还具备金属材料的特定性质，可通过核磁共振研究其在体内的分布。

核酸修饰能解决稳定性和免疫原性问题；但仍然无法解决“入胞”问题。所以基于GalNAc缀合物的直接靶向递送的siRNA逐渐成为第三代siRNA药物，之所以归入新的一代，是因为跟第二代脂质体递送足以形成“降维攻击”的优势差--“直接”递送，避免了脂质分子的免疫原性和细胞毒性，“靶向”提高疗效的同时增加了安全性。

未完待续...

参考文献：

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[9] 核酸药物,时代已至, CICC, 2020

[10] siRNA药物-改变疾病的治疗方式,药时代, 2020

敬请期待《柳暗花明又一村：siRNA药物的诞生之路（下）》

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往期回顾

图文编辑  | 马晴晴

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