小白懂生信 || 生环化材入门级宝典之微生物多样性测序与注释

微生物多样性分析

微生物群落测序，又名菌群多样性分析，是指的是通过对含有微生物的样本进行高通量测序以了解样本中微生物的物种（群落）组成情况及其相对丰度。其中对于原核生物，通常采用的是16S rDNA测序。

16S rDNA简介

16S rDNA是细菌的系统分类研究中最有用的和最常用的分子钟，其分子大小适中，长度约为1542bp，突变率小，存在于所有的生物中，在结构与功能上具有高度的保守性，素有“细菌化石”之称。因此通常采用16s rDNA扩增进行测序分析主要用于微生物群落多样性和构成的分析。

测序区域选择

但实际上由于二代测序平台的读长的限制，在实际检测中16s rDNA扩增测序并不是进行了全长测序，而是对其可变区进行测序就可以区别不同物种。但由于16S rRNA编码基因序列共有V1-V9共9个高可变区，因此选择测序区域是个关键问题。一般我们对V3，V3-V4或V6可变区域进行扩增和测序，但大量的测序试验证明用V3-V4区扩增出菌群结果的可以很好的反应样本的菌群结构用于后续的数据建模分析，是细菌多样性分析注释的最佳选择。

物种注释

PCR扩增之后通过测序得到的是不同的序列，在微生物多样性研究时，为了便于进行分析，通常使用rDNA序列相似性的不同的阈值来将微生物聚类到不同水平。这个时候就需要引入Operational Taxonomic Units（OTU），即分类操作单元。一般情况下，16S rRNA序列的相似性高于97%就可以把归属于同一个OTU，也可以认为是分类到了一个细菌（微生物）的种水平。

同样95%可以对应到属水平，85%可以对应到纲水平，60-70%可以对应到门水平，再通过序列与数据库比对就可以知道是什么物种了。

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