环境小知识 || 手把手教会你食品中脂肪酸测定的操作技巧！

脂肪酸是一类含有长链烃的脂肪族羧酸化合物, 通常以酯的形式存在于中性脂肪、磷脂和糖脂等各种脂质组分中。脂肪酸是食品的重要组成成分, 也是机体能量的主要来源之一。了解食品中脂肪酸的含量, 对于合理规划饮食有很大的帮助。

根据国家标准GB 5009.168-2016《食品安全国家标准 食品中脂肪酸的测定》，食品中脂肪酸测定的定量方法有三种：内标法、外标法和归一化法。食品中脂肪酸测定的前处理方法也有三种：水解-提取法、酯交换法和乙酰氯-甲醇法。

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三种前处理方法的原理：

1.水解-提取法：试样经水解-乙醚溶液提取其中的脂肪后，在碱性条件下皂化和甲酯化，生成脂肪酸甲酯，最后经气相色谱仪分析。

2.酯交换法：将油脂溶解在异辛烷中，加入氢氧化钾-甲醇溶液进行酯交换反应实现甲酯化，然后加入硫酸氢钠，中和体系中剩余的氢氧化钾，最后经气相色谱仪分析。

3.乙酰氯-甲醇法：乙酰氯与甲醇反应得到盐酸-甲醇，使样品中的脂肪和游离脂肪酸甲酯化，最后用甲苯提取，上气相色谱仪进行分离检测。

气相色谱仪

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测定方法示例

1、食品中脂肪酸含量的测定

代表样品：蘑菇 

蘑菇中的脂肪酸含量不高，但其低含量的脂肪酸中，ω-3和ω-6等多不饱和脂肪酸非常丰富，此类脂肪酸有着十分重要的生物活性。蘑菇中37种脂肪酸含量的测定采用气相色谱-质谱联用（GC-MS）的方法。该方法是将样品中的脂肪水解提取后，经皂化和甲酯化后以正己烷提取，然后经气相色谱-质谱检测，最后以内标法定量。该方法具有操作简单，灵敏度高，定性定量准确等特点。

具体操作步骤：

（1）标准溶液及内标溶液的配制：将37种脂肪酸甲酯混合标准溶液转移至10mL容量瓶中，正己烷定容。准确称取适量十九烷酸甲酯于25mL容量瓶中，正己烷定容。

（2）样品前处理：称取打碎混合均匀的样品1g于磨口锥形瓶中，加入100 mg焦性没食子酸和0.2mL内标溶液，再加入2m甲醇，涡旋混匀。然后加入10 mL盐酸溶液，将锥形瓶放入80℃水浴中水解40min。水解完冷却至室温后，加入10mL甲醇，混匀。用60mL乙醚-石油醚(1:1) 分3次萃取水解液，将醚层萃取液合并至100mL磨口锥形瓶中，挥发提取溶剂，残留物为脂肪提取物。

（3）脂肪的皂化和脂肪酸的甲酯化：在脂肪提取物中加入2%氢氧化钠-甲醇溶液8mL，于80℃回流30min。从回流管顶端加入14%三氟化硼甲醇溶液7mL，继续加热回流20min。冷却后，从冷凝管顶部加入饱和氯化钠溶液5mL。取出锥形瓶，准确加入10mL正己烷，振摇后，离心分层。取上清液进GC-MS分析。

（4）仪器条件：进样口温度250℃，分流进样模式，分流比10:1，进样量1μL，柱箱升温程序为140℃保持10min，4℃/min升至240℃保持20min。离子源为EI源，温度230℃。

代表样品：鲜马奶

取样10g 置于离心管中，加入0.05mL 的盐酸水溶液，再加入10mL 的正己烷，振摇3min，中间分多次小心放气。离心10min 后取上清液2.0mL 于10mL具塞试管中，加入0.8mL 的氢氧化钾-甲醇溶液（体积分数0.5%），涡旋1min 后静置10min，取上清液上机分析。

气相色谱检测条件：进样口温度260℃，分流比40:1，检测器温度260℃，载气为高纯度氮气，流速1mL/min。程序升温步骤：初始温度100℃， 保持5min，以8℃/min 升温到176℃，保持5min，再以2℃/min 升温到200℃，保持5min，最后以2℃/min 升温到240℃，保持8.5min。

鲜马奶的脂肪酸组成气相色谱图

2、油脂样品的脂肪酸含量测定

代表样品：食用植物油 

食用植物油中脂肪酸组分较复杂，共有37种脂肪酸。一般采用酯交换法前处理，峰面积归一化法定量。

具体操作步骤：

（1）标准溶液的配制：将37种脂肪酸甲酯混标用异辛烷稀释至10mL，质量浓度为1mg /mL。

（2）样品前处理：称取油样约0.05g至10mL 具塞比色管中，加入4mL 异辛烷，摇匀，然后加入1mL 0.5mol /L 氢氧化钾-甲醇溶液，置于旋转混匀器上于1500r/min旋转2min，加入1mL 超纯水，继续旋转1min，静置分层后，取上层清液待测。

（3）气相色谱分析条件：进样口温度280℃，检测器温度290℃，隔垫吹扫流量3mL/min，初始温度150℃，持续2min，150~235℃，升温速率6℃/min，保持15min。载气为氮气，纯度99.999%，进样量1μL。应用峰面积归一化法计算植物油中脂肪酸成分相对百分含量。

脂肪酸甲酯标准品气相色谱图

图中的1~37分别对应如下：1/C4:0 丁酸甲酯，2/C6:0 己酸甲酯，3/C8:0 辛酸甲酯，4/C10:0 葵酸甲酯，5/C11:0 十一碳酸甲酯，6/C12:0 十二碳酸甲酯，7/C13:0 十三碳酸甲酯，8/C14:0 十四碳酸甲酯，9/C14:1顺-9-十四碳一烯酸甲酯，10/C15:0 十五碳酸甲酯，11/C15:1 顺-10-十五碳一烯酸甲酯，12/C16:0 十六碳酸甲酯，13/C16:1 顺-9-十六碳一烯酸甲酯，14/C17:0 十七碳酸甲酯，15/C17:1 顺-10-十七碳一烯酸甲酯，16/C18:0 十八碳酸甲酯，17/C18:1-n9t 反-9-十八碳一烯酸甲酯，18/C18:1-n9c 顺-9-十八碳一烯酸甲酯，19/C18:2-n62t 反,反-9,12-十八碳二烯酸甲酯，20/C18:2-n6c 顺,顺-9,12-十八碳二烯酸甲酯，21/C20:0 二十碳酸甲酯，22/C18:3-n6 顺,顺,顺-6,9,12-十八碳三烯酸甲酯，23/C18:3-n3 顺,顺,顺-9,12,15-十八碳三烯酸甲酯，24/C20:1 顺-11-二十碳一烯酸甲酯，25/C21:0 二十一碳酸甲酯，26/C20:2 顺,顺-11,14-二十碳二烯酸甲酯，27/C22:0 二十二碳酸甲酯，28/C20:3-n6 顺,顺,顺-8,11,14-二十碳三烯酸甲酯，29/C22:1-n9 顺-13-二十二碳一烯酸甲酯，30/C20:3-n3 顺11,14,17-二十碳三烯酸甲酯，31/C20:4-n6 顺-5,8,11,14-二十碳四烯酸甲酯，32/C23:0二十三碳酸甲酯，33/C22:2 顺13,16-二十二碳二烯酸甲酯，34/C20:5-n3 顺-5,8,11,14,17-二十碳五烯酸甲酯，35/C24:0 二十四碳酸甲酯，36/C24:1 顺-15-二十四碳一烯酸甲酯，37/C22:6-n3 顺-4,7,10,13,16,19-二十二碳六烯酸甲酯。

3、乳粉样品的脂肪酸含量测定

代表样品：婴幼儿乳粉

经乙酰氯-甲醇法前处理，内标法定量。

具体操作步骤：

（1）样品前处理：称0.3g乳粉于顶空瓶中，准确加1mL 碳十一烷酸甘油酸三酯内标溶液，5 mL甲苯，6 mL 10%乙酰氯-甲醇溶液，充氮，密封，80℃水浴反应2 h，取出顶空瓶振摇，冷却至室温，内容物转移至50 mL离心管，取3mL 6%碳酸钠溶液洗涤顶空瓶，重复洗涤3次，合并洗涤液，4000 r/min离心5min，取上清液，加2g无水硫酸钠，离心，取上清液过膜上机测试。

（2）气相色谱分析条件：进样口温度260℃，分流比1:5，初始温度100℃，保留1min，以10℃/min升温至180℃，保留2 min，以5℃/min升温至230℃，保留20 min；检测器温度270℃；氢气流速40 mL/min；空气流速400 mL/min。

该方法中，乙酰氯-甲醇法前处理仅需一次水解和一次提取，操作简便，且由于乙酰氯的化学性质，对以包埋形式添加脂肪酸的样品有更好的水解作用，这使得乙酰氯甲醇法的水解效果更优于酸水解和碱水解，更适用于乳粉中脂肪酸的测定。

参考文献：

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[3] Pietrzak-Fiecko R，Kamelska-Sadowska A M. Fatty acids composition of selected mammals’ milk[J]. Proceedings of the Nutrition Society，2020，79（OCE2）：E319.

[4] 邹燕娣，包李林，周青燕，等. 两种色谱柱分离37种脂肪酸组分研究[J]. 中国油脂，2019，44（10）：156-160.

[5] 刘颖沙，崔利辉，赵璐，等. 植物油中脂肪酸的气相色谱法测定[J]. 湖北农业科学，2020，59（8）：129-133.

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