【1分钟学实验】细胞运动的研究大法——划痕、迁移和侵袭少不了

细胞的运动是机体新陈代谢与基本生命特征之一。在低等生物中，原始细胞通过变形和伪足活动趋近食物和远离伤害。在高级生物体的生命活动中，细胞的定向迁移与胚胎形成、神经发育、免疫应答、器官成熟等密切相关。人类的许多重大疾病及其治疗，如肿瘤转移，神经修复、干细胞功能再生等等都与细胞运动息息相关。

细胞运动性研究在发育生物学、神经生物学、癌症与干细胞生物学等诸多前沿科学领域具有重大研究意义。然而长期以来细胞运动性检测是一个技术难点，但随着生物科学的迅速发展，目前常规可用于细胞运动性评估的方法有很多，这些方法各有千秋，今天菌菌就给大家讲解几种常用的研究细胞运动的实验方法，搬好小板凳听讲了！

常见的几种细胞

 原生癌细胞的迁移与侵袭

恶性黑色素瘤细胞侵入机体正常组织

一、 细胞划痕

1、实验原理：

细胞划痕（修复）法是一种简捷的测定细胞迁移运动与修复能力的方法，类似体外伤口愈合模型，在体外培养皿或平板培养的单层贴壁细胞上，使用枪头或者其他硬物在单层细胞的中央区划线，去除中央部分的细胞，然后继续培养细胞至实验设定的时间（采用低血清或者无血清培养基培养以排除细胞增殖的影响），取出细胞培养板，观察周边细胞是否生长（修复）至中央划痕区，以此判断细胞的生长迁移能力。

实验通常需设定正常对照组和实验组，实验组是加了某种处理因素或药物、外源性基因等的组别，通过不同分组之间的细胞对于划痕区的修复能力，可以判断各组细胞的迁移与修复能力。

2、实验步骤

1) 将所需的材料进行灭菌，包括直尺和marker笔；

2) 用marker笔在6孔板背后，用直尺比着，均匀的划横线，大约每隔0.5--1cm一道，横穿过孔。每孔至少穿过5条线；

3) 消化细胞，在孔中加入约3-5×10⁵个细胞，（具体的细胞数量因细胞种类不同而不同，可以自行进行摸索，但一般接种原则为过夜后融合率达到100%）；

4) 第二天用枪头比着直尺，尽量垂直于孔板背后的横线划痕，枪头要垂直，不能倾斜(不同孔之间最好使用同一只枪头)；

5) 每孔中加入2 mL PBS，清洗细胞3次，去除划下的细胞，然后加入无血清培养基或者低血清培养基（小于2%）；在实验组中依据自己的实验设计加入药物或者其他处理因素；

6) 放入37℃ 5% CO₂细胞培养箱中进行培养；

7) 可按0，6，12，24h时间点取样，拍照(具体时间依实验需要而定)；

8) 拍照结束后使用Image J软件进行数据分析。 

二、 Transwell迁移/侵袭

实验原理：

细胞迁移与侵袭实验将Transwell小室放入培养板中，小室内称上室，培养板内称下室，上室内盛装上层培养液，下室内盛装下层培养液，上下层培养液以聚碳酸酯膜相隔。

将细胞种在上室内，由于聚碳酸酯膜有通透性，下层培养液中的成分可以影响到上室内的细胞，从而可以研究下层培养液中的成分对细胞生长、运动等的影响。应用不同孔径和经过不同处理的聚碳酸酯膜，就可以进行共培养、细胞趋化、细胞迁移、细胞侵袭等多种方面的研究。

在Transwell迁移实验中常用8.0、12.0 µm膜小室，在上室种肿瘤细胞，下室加入FBS或某些特定的趋化因子，肿瘤细胞会向营养成分高的下室跑，计数进入下室的细胞量可反映肿瘤细胞的迁移能力。而在这里呢，我们主要讲解细胞迁移/侵袭实验，其他的实验与此原理相致，大家如有需要可以自行了解呢！

小室示意图

2、实验步骤

（一）细胞迁移

1) 消化、计数细胞：取对数生长期细胞，胰酶消化细胞，离心后使用无血清培养基重悬细胞，计数，调整细胞密度 ；

2) 细胞铺被：取200 μL细胞悬液加入到上室中（细胞接种量因细胞种类和迁移能力不同而不同）；在下室（即24孔板底部）中加入500-600 μL完全培养基；

3) 细胞孵育：培养箱中孵育，常规孵育12-48h(主要依细胞侵袭能力和细胞数目而定)。24h较常见；

4) 固定：用镊子小心取出小室，弃掉培养基，在PBS中清洗 3遍 ，移到预先在下室中加入500μL 4%多聚甲醛中，上室中加入200 μL多聚甲醛，室温固定20min；

5) 染色：取出小室，弃掉多聚甲醛，在 PBS清洗 3遍，移入到预先在下室中加入500 μL 0. l%结晶紫中，室温染色10-15min；

6) 取出小室，弃掉染液，在PBS中清洗三遍，使用湿棉签轻轻的将内室的细胞擦去，留外室细胞;

7) 观察拍照：在显微镜下观察拍照；

8) 结果分析：使用Image J软件。

（二）细胞侵袭

细胞侵袭实验与迁移不同，体外侵袭实验首先是采用人工重构基底膜材料Matrigel，可以在37℃逐渐凝固成胶，结构与天然基质膜结构极为相似。通常的实验是在孔径8μm的滤膜上铺上一层Matrigel，细胞不能自由穿过，必须分泌水解酶，并通过变形运动才能穿过。实验之后通过对穿过“基质膜”的细胞进行计数，来确定细胞的侵袭能力。

1) Matrigel在4℃过夜融化；

2) 用4℃预冷的无血清培养基稀释Matrigel至终浓度1mg/ml（基质胶浓度的依据实验要求和细胞种类不同），冰上操作；

3) 在小室上室底部中央垂直加入100μl稀释后的Matrigel，37℃温育4－5小时使其干成胶

4) 后续步骤同细胞迁移实验步骤状；

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