知识分享 || 调节微环境，治疗动脉粥样硬化！

导语

动脉粥样硬化（AS）是全球心血管疾病的主要致命因素，因为动脉粥样硬化斑块破裂和相关血栓形成，导致急性心肌梗死、卒中等严重并发症。而慢性炎症微环境是促进动脉粥样硬化进展的主要环境。目前已经证明调节炎症信号是调节动脉粥样硬化斑块进展的一种强有力的治疗策略，调节活性氧（ROS）的产生是其中一种有效的治疗途径。因此通过清除斑块巨噬细胞中的ROS，减轻氧化应激损伤，调节微环境中巨噬细胞的极化，进而来调节AS的进展至关重要。

模型建立

动脉粥样硬化小鼠模型的建立：Apoe^−/−小鼠（6周）喂食高胆固醇饮食（HCD）（40%脂肪和1.25%胆固醇）8-12周，构建动脉粥样硬化模型。

实验思路

结论

设计并制备了37pA修饰的巨噬细胞靶向Pt脂质纳米颗粒（37pAPtLNP），利用Pt的纳米酶性质来降低细胞内ROS。此外引入TRAF6抑制剂6877002负载的巨噬细胞靶向LNP（37pA-LNP/6877002）来抑制CD40诱导的经典炎性NF-kB通路的激活。然后研究在高胆固醇饮食（HCD）中37pA-PtLNP和37pALNP/6877002抑制炎症细胞招募和调节动脉粥样硬化模型斑块进展的潜在应用。结果发现ROS淬灭剂37pA-PtLNP可以在骨髓来源的巨噬细胞中积累，减轻细胞内氧化应激，调节斑块微环境。然而，37pA-PtLNP不能有效阻断M1表型巨噬细胞的衍生化。接下来进一步与37pA-LNP/6877002共同给药抑制巨噬细胞向M1表型的极化，这也减少了M1巨噬细胞介导的炎性细胞因子的产生。更重要的是，在共同施用37pA-PtLNP和37pA-LNP/6877002后，观察到显著的斑块消退，并且还通过降低氧化应激和抑制促炎细胞因子的释放来实现炎症免疫反应的调节。

研究结果

1.37pA-PtLNP的合成及表征

首先合成了直径约为20 nm的Pt纳米星（Fig. 1B）。Pt纳米星通过（2-吡啶基二硫醇）丙酸酯功能化的脂质稳定，然后通过37pA肽包埋的磷脂层融合（Fig. 1A）。37pA-PtLNPs的表面脂层进一步用高分辨透射电镜和扫描电镜观察（Fig. 1C，E）。EDX元素映射证实了P和S在Pt金属上的均匀分布，证明了Pt纳米星成功的脂质融合（Fig. 1D，E）。XPS显示了Pt和S的结合能，为Pt−S相互作用提供了化学基础（Fig. 1F）。

在不同浓度的H₂O₂存在下，通过循环伏安法研究证实37pA-PtLNP具有显著的氧化还原电位（Fig. 2A）。接下来研究了37pA-PtLNPs在不同浓度下的清除ROS的活性，结果显示在37pA-PtLNP存在时ESR信号急剧下降，表明37pA-PtLNP对∙O₂^-和∙OH清除的高灵敏度（Fig. 2B，C）。此外∙OH可以通过MB脱色试验和紫外-可见分光光度计进行验证。37pA-PtLNP在250 ng/mL的浓度下消除了芬顿反应产生的∙OH（Fig. 2D）。37pA-PtLNP表现出类似CAT的活性，并可以在中性环境中以剂量依赖的方式分解H₂O₂（Fig. 2E）。进行ABTS⁺∙漂白试验37pA-PtLNP显著清除了总自由基（Fig. 2F）。高水平的ROS会加剧巨噬细胞的氧化应激损伤，从而破坏线粒体功能，诱导促炎因子的释放，这有助于斑块中炎症环境的持续存在。因此评估了37pA-PtLNP对ROS损伤的细胞的保护作用。在不同处理后孵育24小时并收集细胞，通过流式细胞仪测定37pA-PtLNP的ROS清除效果（图2G–L）。LPS + IFN-γ和H₂O₂处理分别显著提高RAW264.7细胞和HUVECs细胞内ROS水平，不同浓度的37pA-PtLNP预处理显著降低细胞内ROS水平（图2G，I）。MitoSOX和流式细胞仪显示，与H₂O₂组相比，37pA-PtLNP预处理后的HUVECs线粒体红色荧光强度降低，表明37pA-PtLNP在抗炎治疗中具有潜在的应用价值（图2K，L）。

2.37pA-LNP/6877002的构建与表征

37pA-LNP/6877002通过在PCEC聚合物核上表面涂覆37pA肽包埋的脂质层来制备（Fig. 3A）。TEM观察到LNPs和37pA-LNP由多个具有光滑表面的小颗粒组成的球形NP，而37pA-LNPs的特征在于脂质层表面上的螺环标记（Fig. 3B）。DLS显示37pA-LNP的水动力直径为100-200nm，表面zeta电位为≈−0.4 mV。J774A.1和RAW264.7细胞的共聚焦显微镜成像证实了37pA-LNP而不是LNP被有效摄取（Fig. 3D）。这种细胞摄取行为通过包埋37pA而增强，流式细胞仪也验证了37pA-LNP的靶向细胞摄取效应（Fig. 3E）。通过评估对小鼠巨噬细胞的细胞毒性，进一步实现了该纳米系统的生物安全性（Fig. 3G）。

3.对RAW264.7细胞的生物学效应

NF-κB信号激活可被CD40-TRAF6小分子抑制剂6877002特异性阻断，从而降低炎症反应。接下来评估了37pA-LNPs/6877002和37pA-PtLNPs对RAW264.7细胞极化的生物学效应（Fig. 4A）。用LPS + IFN-γ处理细胞24小时，大约70%的M1细胞从M0表型中被刺激出来。即使在用37pA-PtLNPs预处理后，仍有高比例的RAW264.7细胞保持M1样形态和iNOS的高表达，这与LPS + IFN-γ治疗组相似。37pA-LNPs/6877002-和37pA-LNPs/6877002+37pA-pt LNP-治疗组表现出M2类型的形态学改变和iNOS表达减少（红色荧光）（Fig. 4B）。流式细胞术结果显示，通过用37pA-PtLNP、37pA-LNPs/6877002或两者预处理，M1生物标志物CD86的表达分别降低至约50%、30%和20%。除了在37pA-PtLNP处理的组中，37pA-LNP/6877002和37pA-PtLNP给药阻断了RAW264.7巨噬细胞向M1样表型的转变，其特征是CD86和iNOS的表达下调（Fig. 4C，D）。

4.对骨髓（BM）源性巨噬细胞的生物学效应

为了进一步研究37pA-LNPs/6877002和37pAPtLNPs是否能抑制AS微环境中巨噬细胞向促炎表型的分化，研究人员从C57B/6小鼠胫骨中分离出髓系细胞，并进一步培养并分化为BM来源的巨噬细胞（Fig. 5A）。通过流式细胞术检测不同处理后BM来源的巨噬细胞中M1生物标志物CD86的表达。结果显示LPS + INF-γ激活显著增加BM来源的巨噬细胞CD86的表达，37pA-PtLNPs预处理略微降低CD86的表达。有趣的是，37pA-LNPs/6877002阻断了LPS +INF-γ诱导的促炎反应，同样，两种药物预处理降低了LPS + INF-γ诱导的CD86表达增加（Fig. 5B，C）。WB进一步证实了在各种处理后巨噬细胞极化相关蛋白表达的改变。与未处理和IL-4刺激的细胞相比，LPS + INF-γ刺激的BM来源的巨噬细胞增加了iNOS的表达，而IL-4刺激的BM来源的巨噬细胞表现出增加的CD206表达，这表明BM来源的巨噬细胞分别被LPS + INF-γ和IL-4成功极化为M1和M2型。iNOS的蛋白表达被37pA-LNPs/6877002预处理轻微下调，而37pA-PtLNPs则增加了iNOS的表达。用两种药物预处理后iNOS的蛋白表达下调更明显，表明它们对BM来源巨噬细胞的M1极化有潜在的抑制作用（Fig. 5D，E）。然而，在每个治疗组中没有观察到CD206表达的显著变化（Fig. 5D，F）。定量分析表明LPS显著增加巨噬细胞释放的TNF、IL-6和IL12p70。相比之下在用37pA-LNPs/6877002或37pA-PtLNPs预处理的组中观察到这些促炎因子的释放显著减少，特别是在联合预处理组中，这表明了促炎信号的阻断（Fig. 5G-I）。

即使37pA-LNPs/6877002可以适度阻断LPS + INF-γ刺激的促炎反应，但是没有观察到37pA-LNPs/6877002单独治疗的剂量依赖性的抗炎作用。然而37pA-PtLNPs和37pA-LNPs/6877002的协同作用进一步降低了响应LPS + INF-γ的巨噬细胞上CD86的表达，表明了预期的影响（Fig. 6A，B）。WB分析显示37pA-LNPs/6877002下调iNOS的表达（Fig. 6C，D）。

5.37pA-LNP在动脉粥样硬化斑块中的靶向亲和力

构建 ApoE^−/−小鼠模型，研究37pA-LNP对动脉粥样硬化斑块的体内靶向亲和力。两组ApoE^−/−小鼠分别静脉注射荧光负载的LNPs和37pA-LNP。体内PA成像显示37pA-LNP治疗后，主动脉弓部位的PA信号显著高于LNP治疗组（Fig. 7A）。给药24小时后分离的主动脉的体外荧光成像进一步显示37pA-LNP/ IR780定位于主动脉弓部位（Fig. 7B，C）。免疫荧光染色显示动脉粥样硬化斑块区域中37pA-LNP（红色荧光）的显著累积和CD68+斑块巨噬细胞的定位（绿色荧光）比LNP治疗组高约86.3%（Fig. 7D，E）。

6.37pA-LNP/6877002+37pA-PtLNP对动脉粥样硬化斑块的抗炎治疗

37pA-LNP纳米系统可以有效地靶向并积累在动脉粥样硬化斑块上。体内治疗时ApoE^−/−小鼠每周注射不同纳米系统2次，对照组小鼠给予PBS治疗（Fig. 8A）。主动脉弓和腹主动脉切片通过H&E染色进行组织学检查，并通过免疫荧光染色分析巨噬细胞在动脉粥样硬化斑块中的分布。37pA-LNP/6877002+37pA-PtLNP治疗组表现出最佳的抗动脉粥样硬化效果，主动脉斑块面积与腹主动脉斑块面积的比率分别降低了65.7%和83.0%（Fig. 8B，C）。通过CD68免疫荧光染色检测了动脉粥样硬化斑块中巨噬细胞的定位，进一步评估了其对AS的治疗效果。在37pA-LNP/6877002+37pA-PtLNP给药后观察到更显著的治疗效果（Fig. 8D）。使用HALO病理分析，检测每个主动脉切片斑块中的CD68+巨噬细胞，并对每个切片中的CD68+巨噬细胞进行定量分析。结果显示37pALNP/6877002+37pA-PtLNP处理显著减少了炎症细胞的积累（Fig. 8E，F）。

研究了每种处理对系统环境中的单核细胞和巨噬细胞的影响。在用37pA-LNPs/6877002处理或共给药后，观察到脾脏中CD45⁺CD11b⁺F4/80⁺细胞（巨噬细胞）和CD45⁺CD11b⁺Ly6C^Hi单核细胞的比例增加（Fig. 9A，C，D）。骨髓中CD45⁺CD11b⁺CD11c^-ly6C^Hi单核细胞的百分比也成比例增加（Fig. 9B，E）。3联合治疗组显著减少了促炎细胞因子TNF-α、IFN-γ、MCP-1、IL-1α和IL-1β的分泌，还观察到了IL-6水平的适度降低，表明免疫炎症反应得到抑制（Fig. 9F）。

参考文献

Qian Yang, Hong Jiang, Yue Wang, Xiao Leng, Yantang Wang, Jie Tong, Yang Zhou, Chunfen Mo, Jinrong Peng, and Huile Gao. Plaque Macrophage‐Targeting Nanosystems with Cooperative Co‐Regulation of ROS and TRAF6 for Stabilization of Atherosclerotic Plaques. Advanced Functional Materials, 2023: 2301053.

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