北大团队：借助AI+冷冻电镜，首次以原子尺度看见生命源头！

智药局出品

人类的生命分子机器，主要通过非平衡动力学、复杂的结构变化过程，来实现其特殊功能。

同时，还受各分子之间相互作用的精准调控……

而精准观察其内部的复合动力结构，对于靶向药物设计至关重要；传统技术很难获取这一复合物的动态标底。

如何以原子水平，去观察天然态超大分子机器的功能动力学过程？

4月27日，一篇刊载在Nature的研究表明，利用深度学习的高精度四维重建技术，应用于时间分辨冷冻电镜，可深度阐明人源蛋白酶体的动力学调控过程及构象重编程机制。

该研究由北京大学毛有东教授团队完成。全部冷冻电镜数据在北大电子显微镜实验室和冷冻电镜平台上完成采集，大部分数据分析工作在北大高性能计算平台上完成。

以下为论文研究精要：

团队发现，USP14的活化同时依赖于泛素识别和蛋白酶体RPT1亚基的结合。

其通过别构效应，诱导蛋白酶体同时沿着两条并行状态的转变路径，从而发生构象变化。

欣喜的是，团队成功捕获了从底物降解中间状态，向底物抑制中间状态的瞬时转化。

在底物降解途径中，USP14活化变构地重编程AAA-ATP酶马达的构象景观和统计分布，并刺激20S底物通道的打开，从而观察到底物持续转运过程的ATPase六聚马达非对称ATP水解和近乎完整的全周循环周期。

图2: 通过时间分辨冷冻电镜分析获取的USP14调控蛋白酶体底物降解的并行路径模型

USP14-ATPase的动态相互作用，使得ATPase马达底物识别与26S自身的去泛素化酶RPN11催化发生去耦合效应，并在26S的泛素识别、底物的起始易位和泛素链回收过程中引入三个调控检查点（动力学分岔点）。

这些发现为USP14调节26S的完整功能周期提供了全新的高分辨见解，并为USP14靶向药物治疗发现奠定了极为重要的机制基础。

众所周知，蛋白酶体降解底物的过程很快，约在毫秒至秒之间。

因此，课题组成员首先要克服的问题就是“时间分辨”。

正常条件下，想通过冷冻电镜技术捕获此过程的中间态结构，非常困难。研究人员们要想办法让这个过程慢下来。

通过大量的条件摸索、重建反应动力学体系和优化反应条件，包括缓冲体系、反应温度等各种方式，课题组优化出一个较为可行的实验方案，使得时间分辨冷冻电镜技术的应用成为可能。

最终获得了含时的45,193张USP14-26S复合体降解泛素底物过程中的冷冻电镜透射图样，并挑取了3,556,806个USP14-26S-泛素底物复合体的颗粒图像。

接下来要解决的难题是“三维分类”。冷冻电镜捕获的复合体图像需经过一系列的分类，归为不同的构象类别，才能呈现出蛋白反应的动态过程。

而USP14结合到26S蛋白酶体后，使得降解底物的动力学过程更加复杂。

想要在如此多的异构复合体颗粒图像中，鉴别出降解过程的各个时态的高分辨率非平衡构象，传统的三维分类方法无法实现。

图1. (A):  USP14调控下蛋白酶体复合体降解多泛素化底物的原子结构模型之一

低精度的三维分类将导致低分辩的三维重建，从而无法获取原子水平的动力学信息，更无法对含时的数据赋予自洽的动态变化的物理意义。

毛有东教授团队通过自主开发的，新型深度学习高精度三维分类及四维重建方法，捕获了USP14-26S复合体降解多泛素化底物过程中，13种不同功能中间状态的高分辨率（3.0~3.6埃）非平衡构象。

图1.(B): 时间分辨率冷冻电镜解析13种中间态的统计分布随蛋白质降解进程的时间演化

通过时间分辨冷冻电镜分析，重建了受控蛋白酶体的完整动力学工作周期，并结合分子生物学功能和基因突变研究，最终阐明了USP14和26S相互调控活性的原子结构基础和非平衡动力学机制。

这是全球首次将人工智能四维重建技术，应用于提升时间分辨冷冻电镜的分析精度试验。

团队针对重大疾病靶蛋白复合体，实现原子水平功能动力学观测的国际领先原创成果，展示了一种新型的蛋白质复合动力学研究范式。

值得注意的是，Nature同期在线发表专栏推介文章——《Control of human protein-degradation machinery revealed 的Research Briefing》，审稿人和官方编辑团队给出了一致好评。

审稿人表示，“该工作是一项重大研究，终于在原子水平解决了USP14活化和其调控蛋白酶体功能的机制问题”；

Nature编辑团队指出“这一工作通过时间分辨冷冻电镜，结合功能分析，……，呈现了蛋白质降解过程中USP14和蛋白酶体的构象连续体”。

北京大学“博雅”博士后张书文和北京大学物理学院2019级博士研究生邹士涛为共同第一作者。

毛有东教授为通讯作者，现任北京大学终身正教授。其实验室长期致力于数学物理科学、信息科学和生物医学的重大前沿交叉研究。

图：北京大学毛有东教授

基于冷冻电镜的动力学重建方法，围绕蛋白酶体、炎症小体等具有重大临床应用前景的靶点系统展开研究，并在国际上荣获多个“第一”。

2016年，首次发现一个亚稳态构象的核心颗粒物转运通道处于开放状态；（PNAS 2016; 113: 12991-12996）

2018年11月，在Nature首次报道了人源蛋白酶体26S在降解底物过程中的七种中间态构象的高分辨（2.8~3.6埃）结构。（Nature 2019; 565:49-55）

该研究工作得到北京市自然科学基金、国家自然科学基金、国家杰出青年科学基金，北大-清华生命科学联合中心等支持。

[1]论文链接：

https://www.nature.com/articles/s41586-022-04671-8

[2]《自然》 专栏官方点评：

https://www.nature.com/articles/d41586-022-01144-w

—The End—

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