6年被接连拒9次，气得和期刊编辑来回对骂：论科研人是怎样炼成的

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这个工作实验上做了四年多，发表拖了两年，过程极其坎坷艰辛。

来源：Ayumi的癫狂的微博

注：文中“我”是昵称为“Ayumi的癫狂”的微博作者

2021 年 1 月 19 日，在 Cell Research上线了一篇文章，Direct control of store-operated calcium channels by ultrafast laser，我们实现了用激光直接特异性地控制细胞 SOC 钙离子通道，而不需要光遗传技术。我们给出了完整的分子机制，以及在多个细胞系和在体水平上（不开颅的活体小鼠大脑的神经元）上实现了调控。这个工作实验上做了四年多，发表拖了两年，过程极其坎坷艰辛，记录如下。

这篇文章是我的学生程攀和田晓莹为核心做的。最开始是程攀刚刚本科毕设的时候，在我这里做了一些简单的预实验，主要是用飞秒激光刺激细胞，看钙信号的变化。那时我刚开始在交大建实验室，其实就是在测试系统性能，我想着本科生毕设刷一篇 BOE 或者 APL 也挺酷炫，就设计了一个套路化的思路让他去做，很快拿到了一些简单的数据。

我注意到细胞的钙上升对飞秒光的波长极其敏感，当时他在 700，800，和 1000 nm 各测了一组点，同样的钙内流需要激光的功率相差达到 20 倍以上。我非常惊讶，让他进一步测整个 700-1000 nm 的光谱。为了保证数据公平可靠，每次测量前我们都要对系统和细胞进行工程上的 calibration，整个过程异常枯燥琐碎，程攀也多次抱怨，不过好在他坚持了下来。

当整个光谱（就是最后的 Fig. 2a）展现出来的时候，我知道事情一定很复杂，细胞对激光波长的敏感性达到了令人震惊的程度，这绝不是一个简单的多光子激发过程 —— 它对波长不敏感，而是有某个分子参与其中。

我当时想不到会是离子通道，而是猜测是细胞内的某个分子。由于光谱（其实是个残缺的谱，700 nm 以下的数据至今也没有拿到）峰值在 700 nm，对应的双光子吸收特征分子最可能的是 NADH。我请教了学院的 NADH 专家殷老师，他猜测线粒体 - ROS 会是主因。

我心中异常失望，因为这是一个非常无趣且没用的机制。我让程攀测量了线粒体的膜电位、ROS 等所有指标，并使用了一大堆 ROS 的 scavenger，结果再次出乎意料，线粒体的指标在整个钙内流过程中没有变化，mitoROS 也没有变化。

实验走上了死路，但也意味着新的机会。

当时我在和程和平院士有一个简单的合作，我帮他们做一个飞秒激光精确调节线粒体状态的技术工具，刚好程院士来上海开会，我去找他当面讨论了我现在这个工作。程老师非常认真地听了我所有的结果和推测，但他依然说 「除了 NADH，不会有别的可能」。我心中再次极度失望。

然而我和殷老师合作的时候，帮他测到了一个皮肤自荧光的现象，在分析数据的时候，我查了大量的分子光谱的论文，发现 flavin 在 700-800 nm 波段具有非常好的双光子吸收峰。

那么会不会是 flavin？

为了验证这个思路，我设计了一个当时感觉非常精巧后来看来比较低效率的实验，就是在双光子激发后测量 flavin 的自荧光变化。这次猜对了，激光激发区域的 flavin 自荧光出现了显著性下降，而且激光激发钙内流的效率与细胞本身的 flavin 水平呈现极高的相关性。

当然，我当时是思路依然绕着线粒体在打转转。于是我们立刻去费了很大劲调了细胞的 flavin 水平，包括用 RNA 调节 FAD 的酶，使用 RF 以及 FAD 培养细胞等。结果显示，flavin 非常重要。

然而，这些结果却一直和线粒体 - ROS 没有什么关联。我们做了一个精细的观测钙内流的实验，并且用了一大堆各种荧光蛋白去 visualize 钙内流在各个亚细胞结构中传播的过程，发现这个过程是从细胞膜上开始了。所以是离子通道？

整个钙内流的过程是缓慢的，最疑似的莫过于 SOC 通道，当然还有 TRP 通道。程攀争辩说并不能排除细胞内的诸如 RYR，细胞膜上的 P2X，P2Y 等。好在验证 SOC 是我的老本行，我们筛选了一大堆离子通道抑制剂，做了 TRP 和 TRPC 的排除，做了经典的 add back 实验，并用 siRNA 调了 Orai1 的水平。这些结果让我心中已经九成相信，就是 SOC。

于是整个实验过程中最困难的一步来了，钙内流光谱和 flavin 相关，钙内流过程与 SOC 相关，flavin 和 SOC 是八竿子打不着的东西啊，这 tmd 是啥原因。

我们整天都在苦苦查论文寻找灵感，我作为一名极度悲观主义者，程攀更是，我们一度自我怀疑我们的数据有问题。

但我表面上装作信心很足，先不管机制，继续往前做。于是我们先做了一个 Orai1 的分子动态表征，观测了 Orai1 在激光激发的过程中（这个过程很短，最快只需要 63 ms）的聚集现象，并用这个现象进一步给出了一些机制上的结果。我希望能进一步测量 SOC 活化的膜片钳数据，这是离子通道验证的金标准。

我们四处打听哪里有搭载膜片钳的双光子系统，但一无所获。

就在打算放弃了开始写论文投个 BOE 的时候，一个转机出现了。

程攀告诉我，他刚刚听了一个报告，Leica 公司邀请了中科大的鲍进老师讲双光子系统，他会后找鲍老师聊天，发现他们那儿有这个系统。我立刻联系了鲍老师，问能否到他们那里做个实验，鲍老师和我讨论了一些细节之后就答应了，我又进一步联系了他们实验室主任也是中科大生科院院长，我的校友学长薛天教授。薛老师也很 nice 地答应没问题。

既然要过去，只做一个实验性价比不足，我又查了薛老师的工作，发现他们那里还可以看脑片，于是又设计了一个 in vivo 的 demo 实验，鲍老师说没问题。我带着程攀去了合肥，住在科大西区门口的一个破宾馆里。这是我本科毕业十年后第一次回母校，没想到是去做实验的。

在过去的路上，我们依然在讨论可能的机制，到科大的时候已经是晚上，我和鲍老师约好第二天一早去实验室。我带程攀吃了我记忆中的小马烧烤，感觉味道下降了很多，但他作为一个上海读书的土包子，依然震惊于味道居然这么好。

吃过饭，我们各自回房间查文献。

我依然记得那天晚上，凌晨一点多，程攀问我，贺老师睡了吗？我说没有。他说那你来我房间一下，我有重大发现。

我过去一看，程攀说他在看光遗传 BLUF 和 LOV 体系的时候，有一个经典机制，就是 flavin 可以和 Cys 形成硫醚键，我们是否可以参考。

我当时刚刚好也在看 Orai1 的分子结构，我说我知道 Orai1 上有三个 Cys。讨论到了三点多才睡。一切都存在了理论上的解释。

在科大做实验非常不顺利，一方面是在别人的实验室肯定什么都是不顺手的，一方面膜片钳我们都不会，难度也非常大。鲍老师亲自上阵也没解决。

我第二天还有课，就先回了上海，留下程攀继续享受实验和合肥的美食。

在鲍老师和薛老师的支持下，我们最终只拿到了一点点膜片钳的数据，不完整。但我们幸运地拿到了脑片的数据，也就是说，我们这个技术是可以在在体水平上工作的。我又让程攀做了活体小鼠的结果，没想到效果也是出人意料的好。

这时时间已经过去了两年多，程攀处于硕士毕业的阶段。我就先把整个数据整理完，写了一篇机制上很不完备的论文。

我觉得这个工作的核心在于我们第一次发现了激光是可以直接控制 SOC 通道的，可以利用细胞内源性的 flavin 作为感光基团。

我把论文发给了 science 的编辑和 nature biotech 的编辑看。他们都给了很好的评价，于是我就匆匆投了 nature biotech，我的 dream journal，当时我还数了一下，整个中国大陆以第一单位在 nature biotech 上发的论文不超过 10 篇。

论文很快送审，那是 2017 年的暑假，我极度开心，但也非常忐忑，我知道整个工作非常粗糙，漏洞百出，没有完整的机制，通篇都是推测，也缺少应用上的验证。

2017 年 10 月，我在给本科生上课前收到了 nature biotech 的邮件，拒稿，但建议修改后重投。

四个审稿人，审稿意见写了 11 页，只有一个人给了很高的评价，建议补一些小实验，有一个人建议大修，一个人建议把机制做完整，还有一个人没有看懂，长篇大论说这个肯定是 ROS 的机制。

我看得非常生气，那天整个上课的时候都魂不守舍，手都在发抖。

接下来我和学生们认真地把意见一条一条过，一条一条设计实验，基本上除了一个加强在体应用的建议以外，其它的意见我们感觉都可以通过实验论证。我又有点开心，先大致写了一个回应给编辑，问他我们大概这样修行不行。

编辑简单地说，加油，我期待看到你们的修改（拒X1）。

我们最核心的机制基本就是在这个阶段完成的，特别是最重要的 flavin 与 Cys 结合是否通过 thioether bond，以及 Orai1 通过疏水键结合等等。

为了应付所谓应用，我们做了一个很糙的 demo，用拮抗剂抑制了脑片的神经元，然后用激光打开。

这个实验其实也很糙的，但我当时沉醉于做出了一种不需要光遗传的光遗传工作的美梦中，没想太多。

论文改完，已经是 2018 年底，投回去没多久，另外几个审稿人表示问题不大了，但之前那个负面审稿人依然没有被说服，编辑还说你们怎么没有做动物行为学的技术验证呢？

再次拒稿（拒X2）。

我非常不服，appeal 了一次，还是被拒了（拒X3）。

当时心中极其不爽，然后转投了 nature methods，很快送审了。我心中再次充斥了希望。

然后到了 2019 年过年之后，nature methods 意见出来了， 也是四个审稿人，两个人给了很好的意见，都是推荐发表，其中一个给的意见非常有建设性，他建议我们分别把三个 Orai1 上的 Cys 突变掉，这样就能筛选出来 flavin 究竟是和哪个 Cys 结合的。

一个人给了一些修改意见，比较简单，一个人给了四条意见，刀刀见血，分别是，没有膜片钳，没有行为学，没有与光遗传的技术比较，没有通道唯一性的证明。

编辑出人意料的拒稿（拒X4）。

我不服，appeal，再被据（拒X5）。

我心中已经充满了绝望。当时程攀已经在学校待到了最后一刻，即将去纽约大学医学院读博。我对审稿意见还是很佩服的，就让第二个学生田晓莹接手。

为了针对审稿意见做实验，我们需要搞到 Orai1-KO 的细胞。

我查论文的时候看到北大的陈良怡教授之前也做过很多 Orai1 的工作，就抱着一丝希望问他有没有，他说北师大的王友军教授那边有。我联系了王老师，拿到了至关重要的 Orai1-KO 和 Orai1,2,3-KO 的 HEK293 细胞。

为了保险，我们也构建了相应的 HeLa 细胞。我们在这些细胞上做了 Orai1-KO 和 rescue 实验，以及 Cys 三突变实验，找到了 flavin 是和 C195 和 C143 结合。此外我们也做了 FRET 实验，直接证明了 Orai1 在激光激活后确实是形成了分子键结合。

到了这一步，机制上已经非常完备了，唯一的短板还是应用。

我抱着希望投回了 nature methods，但编辑没有送审（拒X6）。

于是我又转投 nature photonics，没想到送审了，很快三个审稿人回来，两个推荐发表，一个给了一点小意见，但编辑居然拒稿了（拒X7）。

我完全不懂为啥，编辑说这个工作太过于生物，建议你投 NCB。

我心情已经糟到了极处，又投了 NCB，这个太难，毕竟是仅次于 Cell 的大刊，不会理我们这种做方法的。

果不其然，论文都没送审就被拒了（拒X8）。

我觉得是不是我写得不好，于是就把论文发给了我的老朋友，东大的 Goda 教授。他把我批了一顿，说这个文章要是一早给他来改，绝对早就发了。我们写得太差。

于是在 2020 年疫情最严重的那几个月，Goda 给我改了一轮又一轮的论文，然后他建议我投 science advances，毕竟被 N 系杂志拒得满头包，新系统新气象。

投给 sci adv 我是很不爽的，它在我心中是和 NC 差不多的 「水刊」，论文质量良莠不齐。我心中带着鄙夷投过去，很快送审，但没想到就很快又被拒（拒X9）。

我看了审稿意见，基本没怎么读我们的文章，如果写 response letter，基本就是给审稿人做科普和反驳。

我心中极其不满，写信给编辑把审稿人骂了一顿，我俩在 email 里来回吵架。

至此我已经感到心力交瘁，Goda 教授让我赶紧投 PNAS。

我因为还想着用这篇文章来争取项目，想搞个快的，于是不听他的，把整个 nature biotech， nature methods，和 nature phtonics 的审稿意见以及 response letter 发给了 cell research 的编辑李党生教授，问他有没有可能快速送审快速决定。我记得他以前和我说过，可以这样操作。

李博士非常认真地读完所有材料和我们的论文，我知道这个是因为他回信的时候还和我罗列了一堆论文里的一些小错误，和我写的 response letter 里不对的地方（这一点让我在最黑暗的时刻感到很温暖），和我说可以给我快速送审。

于是很快论文送审，四个审稿人，三个建议接收，一个提了一些简单的意见，主要还是关于 Orai1 上的蛋白，不一定是 C，也可能是 L。于是我们又补了这么一个实验，论文终于被接收。

Goda 还和我说，这个杂志不好，是你们中国人的自 high，还是 PNAS 好。

我说 PNAS 不过是美国佬的自 high，我看好国产期刊。

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