【述评】基因检测在儿童遗传性癫痫中的应用

癫痫是最常见的儿童神经系统疾病之一，大多数发生于学龄前。遗传因素在癫痫的病因中发挥主要作用。遗传性癫痫患者约占总人口的0.4%，占所有癫痫患者的30%。近年来，随着基因检测技术的发展，特别是二代测序(next generation sequencing，NGS)技术在孟德尔遗传病的致病基因检测中得到广泛应用，癫痫及发作相关突变基因得以明确。本文主要概述了基因检测技术在儿童癫痫诊断中的应用，以及对儿童癫痫检测结果解读面临的挑战进行探讨。

癫痫的遗传学特点

原发性癫痫普遍被认为是由致病基因突变所致，大部分有遗传倾向。致病基因突变主要有单核苷酸变异(single nucleotide variation，SNV)和拷贝数变异(copy number variation，CNV)两种方式，可通过家族性的染色体显性遗传或隐性遗传而致病，但更多以散发性的新发突变为主。

在家族性癫痫中，单杂合突变可引起家族性显性遗传性癫痫，这类癫痫包括常染色体显性遗传性癫痫(如KCNQ2基因突变引起的良性家族性新生儿惊厥)和X-连锁显性遗传性癫痫(如FLNA基因突变引起的脑室旁结节状灰质异位症)。而隐性遗传性癫痫主要由纯合子突变引起的常染色体隐性遗传性癫痫(如ALDH7A1基因突变引起的吡哆醇依赖性癫痫)，或由半合子突变引起的X连锁隐性遗传性癫痫(如ARX基因突变导致的X连锁新生儿痉挛症)。

在散发性癫痫中，新发突变可为单杂合突变或半合子突变(如SCN1A基因突变引起的Dravet综合征)，也可表现为嵌合突变(如PIK3CA基因突变导致的巨脑-毛细血管畸形综合征)。另外，单亲二倍体或新发互补突变引起的纯合子突变也可导致散发性癫痫(如MOCS1基因突变引起的遗传性钼缺乏症A型)。

癫痫基因诊断的策略选择

癫痫的基因诊断随着基因检测技术的发展而不断进步，而各基因检测方法的适用性也因癫痫的临床异质性和遗传异质性有所不同，见表1。一般来说，用于临床诊断的基因检测策略主要包括：候选基因检测；基于NGS技术的基因组(gene panel)、全外显子测序(whole exome sequencing，WES)检测；以及染色体微阵列分析(chromosomal microarray analysis，CMA)。

表1 不同基因检测方法的特点

检测方法	优点	不足
候选基因检测(Sanger测序)	结果直观准确，假性结果极低	单个基因成本高；检测周期长；临床医生需了解疾病相关致病基因
基于NGS的基因组检测	基因组包含多种可疑基因，检出效率高	基因组涉及基因有限；存在假阳性结果，需Sanger测序验证
基于NGS的全外显子测序	检测全基因组外显子；检出效率高	检测成本高；检测周期长；假性结果解读困难；小片段CNV检测能力有待提高；无法检测非编码区序列；可疑阳性结果需Sanger测序验证
染色体微阵列分析	更高分辨率(相比于染色体核型分析)	无法检出染色体平衡易位；需其他方法验证(如荧光原位杂交技术)

注：NGS为二代测序，CNV为拷贝数变异

1．候选基因检测：

候选基因检测是指根据特定的临床表型特点(包括临床表现及家族史)，结合实验室、影像学等辅助检查明确临床诊断后，再进行有针对性的基因检测。其前提是临床医生对该疾病的临床表型及所涉及的基因有充分的认识。特别是对于明确临床表型的癫痫患者，如目前常见的各种儿童癫痫综合征，见表2，候选基因可以是单基因或多个基因。

表2 常见的儿童遗传性癫痫综合征及相关基因

癫痫综合征	基因名称	遗传方式
良性家族性新生儿惊厥	KCNQ2、KCNQ3	常染色体显性遗传
良性家族性婴儿惊厥	PRRT2、SCN2A	常染色体显性遗传
X连锁婴儿痉挛症	CDKL5、ARX	X连锁隐性遗传
葡萄糖转运子缺乏综合征	SLC2A	常染色体显性遗传
吡哆醇依赖性癫痫	ALDH7A1	常染色体隐性遗传
叶酸缺乏病	FOLR	常染色体隐性遗传
Dravet综合征	SCN1A、SCN2A、GABRG2、GABRA1、PCDH19、STXBP1、HCN1	常染色体显性遗传
遗传性癫痫伴热性惊厥附加症	SCN1A、SCN2A、SCN1B、GABA-A GABRD、GABRG2	常染色体显性遗传
限于女性的癫痫伴智力落后	PCDH19	X连锁遗传
进行性肌阵挛性癫痫	EMP2A/laforin、EMP2B/malin	X连锁遗传
大田园综合征	STXBP1、ARX	X连锁隐性遗传

候选基因的经典检测方法是Sanger测序，或是用来检测已知CNV的多重连接探针扩增技术(multiplex ligation-dependent probe amplification，MLPA)等。如Dravet综合征是一种早发性、持续性、严重的癫痫脑病，具有典型的临床表现，可在超过80%的患者中检出SCN1A基因突变。而约15% Dravet综合征患者是由其他基因导致，如HCN1、GABRA1和STXBP1等。另一方面，并非所有SCN1A基因突变阳性患者即诊断为Dravet综合征，如在其他类型癫痫患者、SCN1A携带者甚至无癫痫正常人群中亦可检出SCN1A突变。因此候选基因检测的检测策略具有一定的局限性，其结果是临床医生需要在首选基因检测阴性时，继续寻找新的候选基因，检测时间长、成本高。

2．基于NGS的基因组和WES：

基因组检测是通过目标序列捕获芯片对目标基因组区域DNA进行富集，再利用NGS进行测序。NGS可通过特定的基因组，如癫痫基因组合应用于癫痫的基因诊断，不仅节约诊断时间，也简化了临床医师面临基因检测方法选择时的选择策略，但其阳性结果仍需Sanger测序予以验证。2012年，Lemke等首次利用二代测序对33例不同年龄及不同类型癫痫患者进行目标序列测序，其基因组包含265个癫痫相关基因，最终诊断了16例疑诊遗传性癫痫患者。该研究明确了2例典型Dravet综合征患者SCN1A基因的新生突变(p.R222X和p.R393H)，而其之前Sanger测序均未检出SCN1A基因突变。2013年，Carvill与其研究团队选择包含19个已知基因和46个候选基因的基因组对500例癫痫脑病患者进行检测，最终检出10%的患者存在致病性突变，并最终确认CHD2和SYNGAP1基因的新发突变可导致癫痫脑病。

基因组诊断率与患者临床表型、所选基因组有密切关系。据文献报道，癫痫相关基因组的诊断率大约在10%～48.5%。在实际临床工作中，可通过多种方式提高基因组检测的诊断率，包括：同时对双亲进行基因组检测；通过文献建立更多临床表型谱与基因突变的相关性；及时跟进最新研究，更新基因组。

WES是基于高通量测序技术，对全基因组中编码蛋白的外显子进行测序。人类与疾病相关的遗传变异85%集中于蛋白编码区，编码蛋白的外显子大约有20 000个，因此WES可以确定大部分癫痫的致病基因。Epi4K课题组对264个患癫痫脑病的家庭进行WES分析，在先证者中发现329例患者明确为新生突变，其中包括SCN1A、XTXBP1、CDKL5等5种已知致病基因和4种新的致病基因(GABRB3、ALG13、DNM1、HDAC4)。WES分析也可用于家系遗传性癫痫，在没有利用WES技术前，仅明确良性家族性新生儿惊厥与染色体改变相关，但利用WES分析可明确PRRT2突变。此外WES技术也应用在Sanger测序靶基因突变结果为阴性时，发现基因新生突变，如Suls等利用WES在SCN1A基因突变阴性的Dravet综合征患者中发现CHD2基因新发功能缺失突变。

关于WES的适用检测范围，美国医学遗传学会(American College of Medical Genetics，ACMG)提出以下几种情况适用于WES检测：怀疑遗传性疾病且无其他检测方法；怀疑遗传性疾病但其他基因检测结果阴性；疾病存在遗传异质性，需进行多基因测序；其他特殊产前诊断。WES对疑诊遗传性疾病的患者诊断率约28%～32%，其中对遗传性癫痫患者的诊断率不尽相同，有研究报道在耐药的癫痫儿童中诊断率为14.3%，而另一项包含癫痫的多病种患者研究中诊断率为27%。尽管WES带来了罕见病检测的新思路，但仍存在一些不足之处：WES未涉及非编码区序列变异与结构变异，对于该区域异常引起的癫痫也无法检出(如波罗的海肌阵挛)，可通过全基因组测序分析非编码区变异，或结合染色体微阵列检测CNV；WES在进行二代测序前的外显子区域靶向捕获技术存在捕获不均、捕获偏差等问题，需要通过增加测序深度获得更多序列信息以弥补偏差；可疑阳性结果需Sanger测序予以验证。

3．染色体微阵列分析：

染色体核型是利用显带技术在显微镜下分析染色体结构的有效诊断试验，尽管其显带技术分辨率最高可达4 500 000～5 000 000 bp，仍无法检测基因组中亚显微结构的CNV(微缺失或微重复)。染色体微阵列分析由于其高分辨率特点(可达Kb级)，已替代染色体核型分析成为首选检测方法。CMA利用芯片技术检测DNA探针与样品分子杂交信号获得样品基因信息，明确基因变化区域及序列，尤其是患者出现某些先天性畸形、异常或临床表现为无法提示明确候选基因的症候群时。依据检测平台类型，CMA可分为单核苷酸多态性微阵列(SNP array)和微阵列比较基因组杂交技术(array-comparative geneomic hybridisation，aCGH)。

利用aCGH技术在患有癫痫或发育迟缓的患儿中发现23.5%的患儿存在异常结果，明显高于染色体核型分析。但是CMA也存在其局限性，如无法检出染色体平衡易位(相互易位、Robert易位等)，仍需利用核型分析以弥补不足。对2 000例出生缺陷儿童进行CMA分析，检出率达26.1%。对于该检测结果需谨慎解读，因为该技术可发现许多临床意义未明的染色体微缺失或微重复，如当癫痫与精神迟滞无关时，这些结果可能不足以支持诊断。

总的来说，对于基因检测技术的选择，如果癫痫患儿存在明确的癫痫综合征，可采取候选基因组检测、Sanger测序检测、aCGH检测和WES的顺序进行基因诊断；如果无法对癫痫患儿做出明确临床诊断，则需采取aCGH检测、核型分析、候选基因组检测和WES的顺序进行。

基因检测报告解读及展望

疾病的遗传特征具有异质性，因此，对于报告可能致病性的阳性结果，需结合患者的表型，二者应符合遗传机制。如果没有充分证据证明致病性的突变可以报告为"临床意义未明变异"。同样地，阴性测试结果也并不意味着患者没有发生癫痫的遗传病因，或无与临床表型相关的特异性遗传病因。阴性结果需要结合表型进行解释，以符合临床诊断及其他实验室检查。阴性的结果也可能受限于检测方法或目前的研究进展。相信随着基因检测技术的快速发展，罕见病遗传学数据会不断完善，许多临床意义未知的基因再次检测会有新的发现，更多遗传性癫痫患儿将得到诊断。

本文来源：中华检验医学杂志, 2018,41(5) : 337-340.