类泛素化修饰抑制剂TAK-981通过靶向胰腺癌，可在临床前模型中激活免疫系统并阻止癌细胞周期进展
研究背景
胰腺导管腺癌(Pancreatic ductal adenocarcinoma, PDAC)具有高度促结缔组织增生的特点，这一独特的免疫抑制微环境，对化疗和免疫治疗都有很强的耐药性，导致其5年总生存率仅为9%。目前，增加用于PDAC治疗的新型小分子疗法是一种新的研究导向，类泛素化修饰（Small Ubiquitin-like Modifier，SUMO）是癌细胞周期进展的关键介质，在小鼠模型中，SUMO E1亚基SAE2或UBC9的敲除显著减少了肿瘤的生长，靶向SUMOYlation酶可以作为潜在的抗癌疗法。TAK-981是一种新型的高选择性和强效的SAE小分子抑制剂，但它能否用于临床前同源小鼠PDAC模型的治疗及其作用机制目前尚不清楚。
研究设计
TAK-981处理三种人胰腺癌和一种鼠胰腺癌细胞系，证明了它能够选择性地降低SUMOYlation，导致胰腺癌细胞中有丝分裂失败和染色体分离缺陷，从而阻断细胞增殖。TAK-981处理KPC同源小鼠和免疫受损的NSG小鼠模型，能够降低它们体内的肿瘤负荷。对外周血中免疫细胞亚群丰度评估发现，TAK-981诱导外周血中CD8 T细胞的可逆增加和B细胞的相对减少。单细胞RNA（scRNA）测序表明，TAK-981处理可激活包括T细胞，B细胞和自然杀伤（Natural killer, NK）细胞在内的淋巴细胞的干扰素响应。TAK-981处理离体淋巴细胞激活STAT1并诱导干扰素靶基因。
研究结果
1.SUMO通路成分高表达与胰腺癌进展呈负相关
研究者评估了SUMOYlation抑制剂在胰腺癌组织中的潜在作用，发现与邻近的正常组织和原发性胰腺组织相比，绝大多数癌症样本中SUMO1和SUMO2/3呈现出高表达水平（图1A）。与正常胰腺组织相比，PDAC样本中SUMO通路成分的表达水平显著增加（图1B）。另外，PDAC患者中SUMO1，SUMO2，SUMO3，SAE1，UBE2I的较高表达与较低的总生存率显著相关（补充图1A）。这些结果表明，SUMOYlation与胰腺癌细胞增殖可能具有一定的相关性。
图1 SUMO通路成分在PDAC中过表达是肿瘤细胞增殖的体现
补充图1 TAK-981处理和SUMO E1敲除阻断了SUMO通路的活性和增殖
2.TAK-981通过诱导有丝分裂缺陷来抑制胰腺癌细胞的增殖
研究者首先评估了TAK-981对三种不同人胰腺癌细胞系MiaPaCa2，PANC1和HPAF以及一种小鼠胰腺癌细胞系KPC3中SUMO偶联的SAE抑制作用，结果表明该抑制剂具有特异性。此外，TAK-981呈浓度依赖性地降低胰腺癌细胞系的活力（图1H）。这些结果表明SUMO信号传导对胰腺癌细胞体外增殖至关重要。除PANC1外，所有细胞系均响应TAK-981在sub-G1中细胞比例显著增加，表明TAK-981能够诱导细胞凋亡。
TAK-981处理的细胞表现为伴有有丝分裂阻滞的异常有丝分裂。另外，TAK-981处理24小时后增加了微核的数量，这是由于有丝分裂过程缺陷（补充图2H）而在后期端着丝粒染色体期间滞后的标志。以上结果表明，TAK-981对SUMO E1的抑制会导致细胞周期进展的缺陷，包括染色体分离受损。
图2 TAK-981导致细胞周期阻滞和DNA桥接
补充图2 TAK-981处理后的细胞周期分析
3.通过质谱法鉴定胰腺癌细胞中的SUMO2靶蛋白
研究者鉴定了关键有丝分裂调节因子的SUMOylation以及DNA损伤反应蛋白（图2F）。与无MG132处理的情况相比（图2D和2E），在MG132处理中，观察到SUMO靶蛋白显著增加（图2E）。蛋白酶体抑制后，研究者观察到更大一组细胞周期调节因子和DNA损伤反应蛋白的SUMOYylation（图2G）。这些结果表明，大量的SUMO2靶点被细胞中的蛋白酶体降解，SUMO2共同调节大量的有丝分裂因子和DNA损伤反应蛋白。
4.TAK-981减少小鼠PDAC模型中肿瘤的生长
为了研究TAK-981在体内的抗肿瘤活性，研究者使用KPC同源小鼠模型治疗胰腺癌。结果表明，在KPC的PDAC模型中，使用TAK-981处理小鼠能够有效抑制肿瘤生长（图3B）。
接下来，研究者使用KPC3细胞确定了免疫受损的NSG小鼠中TAK-981的抗肿瘤活性。TAK-981处理延缓了小鼠肿瘤的生长速度（图3D），但它对免疫受损小鼠的肿瘤生长抑制作用相对较弱（图3E）。TAK-981处理诱导淋巴细胞浸润肿瘤且降低了肿瘤中B细胞频率（图3F，补充图3A）。综上所述，TAK-981具有通过调节免疫系统和阻止癌细胞增殖的双重作用模式。
图3 TAK-981处理可减少KPC胰腺癌模型的皮下肿瘤生长
补充图3 流式细胞术分析的门控策略
5.TAK-981在血液中的免疫调节作用
研究者通过确定TAK-981对循环淋巴细胞和髓系细胞的影响，研究了TAK-981潜在的免疫调节作用。TAK-981处理后，小鼠血液中CD8 T细胞和NK细胞的频率增加，嗜中性粒细胞频率适度增加，B细胞显著减少（图4A）。这些细胞频率的显著增加是由于B细胞绝对数量的瞬时减少，而非像荷瘤小鼠所显示的血液中淋巴细胞数量的绝对增加（补充图4A）。
图4 TAK-981促进淋巴器官和外周血中CD8 T细胞和NK细胞的活化
补充图4 流式细胞术检测TAK-981对KPC3荷瘤小鼠的免疫调节作用
6.TAK-981在淋巴器官和骨髓中的免疫调节作用
研究者深入研究了TAK-981对C57BL/6小鼠免疫细胞的影响，以评估TAK-981处理前后外周血，脾脏，淋巴结和骨髓中关键淋巴细胞群体的丰度。结果表明，除骨髓外，外周血、淋巴结和脾脏中CD8 T细胞和NK细胞的频率普遍增加（图4）。CD4 T细胞的比例大多不受影响（图4A-D），但在含肿瘤的小鼠中，淋巴结和脾脏在Fox3P CD4细胞中均呈增加趋势（补充图4B和4C）。B细胞的频率在淋巴器官和骨髓中急剧下降（图4A-D），动力学研究表明，TAK-981处理6小时后血液中B细胞开始减少（图5A和5B）。
图5 TAK-981影响B淋巴细胞的主要亚群并诱导细胞凋亡
7.TAK-981激活淋巴细胞和NK细胞中的干扰素途径
为了寻找SUMO免疫调节作用的潜在机制，研究者进行了scRNA测序（图6A）。TAK-981处理后，主要淋巴群体和NK细胞中干扰素靶基因显著上调（图6D和6E）。研究者证明了STAT1在体外培养的原代脾细胞中通过磷酸化响应TAK-981而被激活，它可以被一种中和I型干扰素受体IFNAR的抗体完全阻断，但不能被中和II型干扰素(IFNγ)的抗体完全阻断（图7A）。结果表明，TAK-981处理通过诱导干扰素信号传导和相关细胞因子来增加外周血中特定淋巴细胞和髓系细胞的比例。
图6 TAK-981在淋巴细胞和NK细胞中激活干扰素途径
图7 TAK-981通过依赖IFNAR和CD8 T细胞的方式减少KPC3的生长
8.TAK-981通过依赖CD8 T细胞和IFNAR减少KPC3的生长
研究者使用中和抗体研究了CD8 T细胞和干扰素信号传导响应TAK-981处理以减少KPC3肿瘤生长的功能作用（图7E）。结果表明，TAK-981通过激活血液和淋巴器官中的CD8 T细胞，NK细胞和DCs以及通过减少B细胞来诱导干扰素信号传导以刺激有效的免疫反应，有助于其在同源KPC3 PDAC模型中减少肿瘤生长。
研究结论
本试验证明了SUMO E1抑制剂TAK-981通过双重作用模式治疗PDAC的潜力，双重作用模式包括癌细胞周期抑制和免疫系统调节，且这种模式在抗癌药物中是独有的。
参考文献
Kumar Sumit,Schoonderwoerd Mark J A,Kroonen Jessie S et al. Targeting pancreatic cancer by TAK-981: a SUMOylation inhibitor that activates the immune system and blocks cancer cell cycle progression in a preclinical model.[J] .Gut, 2022, undefined: undefined.