外泌体揭秘肺癌转移分子作用机制 | 外泌体
还记得上上周的外泌体经典再读么？还有上周的教你如何寻找肿瘤早期诊断标记物吗？这些都是本期外泌体专题中的一部分哦~本周的外泌体专题讲的是啥呢？
看题目你就知道了吧，今天的主题与肺癌有关，是介绍
一.研究目标
1：通过外泌体内容物的测序，对非小细胞肺癌进行早期诊断；
2：通过非小细胞肺癌血液等循环体液的外泌体研究，发现非小细胞肺癌转移，复发，耐药等相关分子机理。
二.样本选择
1细胞系选择
人肺癌细胞株：A549 ,H1299,SK-MES-1,H292,H1650,95D
正常支气管上皮细胞株：HBE
人肺泡上皮细胞株：HPAEpiC
此次选择覆盖了非小细胞肺癌的大多数的细胞类型，同时也覆盖了相应用于后期机制研究的细胞类型，能对后期的研究的覆盖度有个良好的保障，每种细胞类型，选择三个重复样。
2非小细胞肺癌亚型的病例研究
在确定兴趣非小细胞肺癌亚型时，建议选择3～5个患者，进行血液外泌体测序
3biomarker研究：大规模临床样本验证
选择早期的肺癌病人，其他病例，正常人病例，肺炎等100-200例，使用茎环qPCR的方法检测目标miRNA或者micro RNA family，大量数据验证相关性。
三.技术路线
图1 研究思路
四.分析方案
由于外泌体RNA目前的研究集中在“biomarker”和机制研究这两个方向，下面详细介绍这两个方面。
47 31626 47 14940 0 0 3700 0 0:00:08 0:00:04 0:00:04 3700>1Biomarker研究
研究思路与发表在nature的Glypican-1 identifies cancer exosomes and detects early pancreatic cancer一文相似：
一：首先通过大规模的细胞上清外泌体筛选出特异的miRNA；
二：实际的病例血液样本中，筛选出外泌体中的miRNA；
三：将step1,step2当中得到数据取交集（根据miRNA 或miRNA family），得到特异的与早期肺癌发生相关的miRNA。
四：其中需要检测相关miRNA与早期肺癌患者基因组之间的关联性，确定外泌体miRNA能够做为相关早期肺癌相关性的依据（这一过程较为复杂，可能需要反复结合之前的数据）
五：大临床样本验证，其中样品选择已经在上文提及。
2机制研究
机制研究目前主要为外泌体LncRNA，protein，small RNA等；早期肺癌研究，主要为早期癌症的发生，恶化，转移等方向；建议参考Cancer-Secreted miR-105 Destroys Vascular Endothelial Barriers to Promote Metastasis一文。
五.验证方案
一：qPCR验证相关miRNA/LncRNA表达情况，验证测序结果的可靠性；
二：miRNA/LncRNA靶基因验证：使用荧光素酶报告系统和细胞转染后的Western Blot对miRNA和重要靶基因的调控关系进行验证；使用RIP技术，CHIRP等技术，验证LncRNA与靶基因之间的关系；
三：外泌体功能研究：收集实验体系中的外泌体后，将外泌体加入细胞中进行共培养实验，观察不同外泌体对细胞状态（细胞凋亡、增殖等）的影响；
四：外泌体miRNA功能研究：确定外泌体中重要的miRNA/LncRNA后，可直接对miRNA/LncRNA进行功能研究，通过过表达或抑制miRNA/LncRNA的表达观察miRNA/LncRNA对细胞功能的影响；
五：外泌体miRNA/LncRNA靶基因功能验证：对已验证的miRNA的靶基因使用siRNA抑制或过表达对功能进行验证，进一步证明miRNA是通过这些靶基因发挥功能；
六：病人血清外泌体miRNA检测：使用茎环qPCR对前面验证的miRNA进行检测，结合医学统计学分析筛选有潜在功能的biomarker。
六.生物信息学分析
生信分析内容较多，以下对重要的生物信息分析举例说明——Pathway-network关联网络图
信号通路(pathway)注释和信号通路富集性分析后，我们看到的是孤立的信号通路。然而，体内的信号通路是相互联系的，一个信号通路的激活将会引起其他信号通路的激活。
图2 关联网络图
本期思路解析就说到这里了，有没有对你的科研思路有所启示呢？下期小编会继续为大家深挖外泌体相关的研究思路，记得来学习哦~
文中提到的文章，有需要原文的也可以向小编索要，没办法，就是介么大方~
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