案例解析：拟南芥去甲基化酶ALKBH10调控成花转变 | m6A专题

论文标题：ALKBH10B Is an RNA N⁶-Methyladenosine Demethylase Affecting Arabidopsis Floral Transition

刊登日期：2017年12月

发表杂志：Plant Cell

影响因子：8.68

研究机构：北京大学贾桂芳/何川课题组

前言

目前国内外大部分RNA甲基化研究都集中在基础生物学与医学方向，而关于植物RNA甲基化的研究仍然偏少。2014年何川/贾桂芳课题组在Nature Communications上发表研究，利用m6A-seq首次对拟南芥RNA甲基化进行了报道。另外中科院北京基因组研究所以及西北农林科技大学也分别在RNA Biology及Genome Biology上利用m6A-seq对水稻和拟南芥的不同组织部位进行研究。

拟南芥中已鉴定了大量RNA甲基化酶，如METTL3同源基因MTA，METTL14同源基因MTB，WTAP同源基因FIP37以及KIAA1429同源基因Virilizer。去甲基化酶包括ALKBH9A, ALKBH9B, ALKBH9C, ALKBH10A以及ALKBH10B等。其中MTA介导拟南芥胚胎后的转录调控，FIP37与MTA互作，是甲基化酶复合物的重要组成部分。

本文中贾桂芳课题组利用拟南芥ALKBH10b（At4g02940）突变体研究去甲基化酶如何对拟南芥开花早期的成花转变进行调控。结果显示，ALKBH10b通过介导FT, SPL3和SPL9的去甲基化修饰，并且证实幼年期→成年期关键分子miR-156不参与调控该通路，而是ALKBH10b特异性调控拟南芥成花转变过程。最后论文通过RNA甲基化测序m6A-seq挖掘了1000多个基因发生了差异甲基化修饰，这些基因直接或间接受到了ALKBH10b的影响。

论文框架与流程

体外实验证实ALKBH10b行使去甲基化作用

作者先使用BLAST算法，把人源ALKBH5酶与拟南芥的几种酶进行同源序列比对分析，列出了五个候选酶：ALKBH9A, ALKBH9B, ALKBH9C, ALKBH10A和ALKBH10b。结果显示，ALKBH10b在拟南芥几乎所有组织中表达丰度都很高，而且在花期表达量最高。ALKBH9B和ALKBH9C这两种酶的丰度紧接其后。

作者在下一步使用ALKBH9B和ALKBH9C两种拟南芥突变体来验证m6A修饰水平，结果表明mRNA甲基化水平并无明显变化。所以作者选定ALKBH10b作为后续的研究目标。

接下来作者分别结合使用了烟草瞬间转染实验以及纯化后的ALKBH10b来研究去甲基化酶在体外的修饰现象。LC-MS/MS分析表明，m6A甲基化水平在体外降低了50%。

最后作者将ALKBH10b行使催化活性关键结构域上的氨基酸残基H366A/E368A进行突变后，ALKBH10b的去甲基化修饰活性被破坏。此外作者还比较了人源ALKBH5在同等条件下与ALKBH10b是否在催化能力上相似。结果表明，ALKBH10b比ALKBH5在催化ssRNA上活性略低，而具有茎环结构的structured RNA两者并无明显差别。另外ALKBH10b只对m6A有特异性去甲基化催化功能，而m1A则没有催化功能。

带有m6A甲基化修饰的mRNA为ALKBH10b的底物

为了在拟南芥体内验证ALKBH10b的功能，作者构建了2个突变体：alkbh10b-1（ALKBH10B FeII结合位点前外显子插入T-DNA）和alkbh10b-2（ALKBH10B预测α-KG结合位点前内含子插入T-DNA）。RT-PCR实验表明alkbh10b-1几乎不产生任何ALLBH10b的转录本，而alkbh10b-2只产生不到5%的转录本。

当去甲基化酶ALKBH10b催化功能被破坏后，RNA整体的m6A/A的比例开始升高（即甲基化水平上升）。接下来作者进行补救实验（rescue）对alkbh10b-1和alkbh10b-2进行了ALKBH10b的过表达实验，拟南芥表型得到补救恢复到野生型但alkbh10b-1补救效果比alkbh10b-2要更优。在野生型中过表达ALKBH10b（35S），甲基化水平也是显著下降。

作者对其他几种甲基化转移酶如MTA、MTB、FIP37等进行了qPCR验证，发现并无明显差异。表明ALKBH10b直接参与RNA的去甲基化修饰，使得拟南芥m6A水平发生变化且与甲基化转移酶无关。

已经有大量的研究，尤其是动物中，核糖体RNA、tRNA等也存在可逆化甲基化修饰和去甲基化修饰。但是最后作者在拟南芥中证实，rRNA和tRNA并不受ALKBH10b的调控，且ALKBH10b也不会对其他类型的碱基修饰如m1A、m5C、m1G等有去甲基化的修饰作用。

所以ALKBH10b的底物不具有广谱性，既不会对rRNA、tRNA上的m6A有去甲基化修饰作用，也不会对其他修饰如m1A等有催化功能。

ALKBH10b影响拟南芥成花转变和营养生长

作者对alkbh10b-1突变体进行长时间观察后发现，野生型在展开第12片真叶（true leaves）后开花，而alkbh10b-1则花蕾绽放前额外多出了7片真叶。相反的是，在野生型中过表达ALKBH10b在产生7片真叶后提早进入花期。在alkbh10b-1突变体中进行ALKBH10b补救实验，可对alkbh10b-1中原本ALLBH10b产生缺陷的表型进行补救，从而恢复到野生型的表型水平。然后，针对alkbh10b-1进行ALKBH10b H366A/E368A（即催化结构域被突变的ALKBH10bm）的补救后，发现表型依旧没有恢复到野生型水平。最后作者得出结论ALKBH10b功能缺失后成花转变延后，营养生长受到抑制。

ALKBH10b介导去甲基化修饰提升开花关键基因转录水平

已知FT基因（Flowering Locus T）参与拟南芥叶片光周期、叶片春化、赤霉素和衰老通路。在alkbh10b-1突变体中，FT基因表达量显著降低，花期延后。说明ALKBH10b能够调节FT基因的丰度最终影响成花转变。为了进一步证实m6A甲基化修饰参与FT表达，作用使用了m6A-RIP-qPCR技术对FT甲基化水平进行检测后发现，超过50%的FT在alkbh10b-1中发生了m6A甲基化修饰，而野生型中m6A修饰水平不到30%。此外，与FT基因相关的SPL3和SPL9在alkbh10b-1突变体中甲基化水平也是显著提升，转录水平显著下降。通过m6A-RIP-qPCR技术对片段化的mRNA进行检测后发现，FT基因Peak主要位于起始及终止密码子，SPL3及SPL9的Peak主要位于3’UTR区域。所以结合m6A-RIP-qPCR实验不仅证明了ALKBH10b直接参与介导FT、SPL3和SPL9的去甲基化修饰，同时表明去甲基化修饰是一种转录后调控基因表达水平的一种方式。

ALKBH10b维持FT, SPL3和SPL9的稳定性并影响成花转变

在哺乳动物中，先前已有大量实验证实YTHDF2作为reader可以对发生甲基化的mRNA进行降解。为了在拟南芥中证实这种猜想，作者开展了两项独立实验来对FT基因在整个生命周期中的降解情况进行实时监控：a. 在转录水平最高的白天Z16期前使用转录抑制剂放线菌素D（actinomycin D）监控FT的转录水平；b. 在夜晚Z16后检测FT的降解水平。两种方法同时证实在alkbh10b-1突变体中FT降解速度比野生型拟南芥更快。这个现象表明，当拟南芥中甲基化水平提升时，mRNA会加速降解。当在alkbh10b-1中进行ALKBH10b过表达时，FT甲基化水平降低，mRNA维持稳定性（即不被快速降解）。

已知miR-156调控SPL基因。宾夕法尼亚大学的Scott教授与浙江农林大学的吴刚教授首次发现miR-156是控制植物幼年向成年阶段转变的主控因子，并揭示了控制该发育进程的信号通道。但是在本次实验中，作者证实miR-156并不参与调控SPL3和SPL9。这表明SPL3和SPL9转录水平下降与miR-156没有关联。所有结果均表明去甲基化酶ALKBH10b能够维持FT、SPL3和SPL9 mRNA的稳定性。

FT、SPL3和SPL9的高甲基化水平能够加速降解，而FT的缺失导致花期延后。在叶片中，SPL9能够激活miR-172从而调控花期，而SPL3能够直接与FT的启动子相结合。在alkbh10b-1中miR-172成熟体和前体数量均显著下降。所以SPL3和SPL9因为高甲基化修饰导致转录水平下降，使得FT和miR-172受到抑制，从而导致成花转变延后。

ALKBH10b缺失导致拟南芥整体m6A修饰水平降低

作者使用了m6A-seq和转录组测序等手段，通过多组学联合分析最终发现在野生型拟南芥中的9210多个基因挖掘到了12922多个Peak；alkbh10b-1突变体的8000多个基因中挖掘到了12975个Peak。差异分析表明，alkbh10b-1中共鉴定到1190个基因存在1276个过甲基化修饰Peak。m6A修饰主要位于TSS、TES以及3’UTR和5’UTR附近。本次测序结果中m6A Peak基本集中在RRACH motif内。GO功能富集分析表明，差异基因基本与器官组织发育、生殖成熟及开花转换等功能相关。这个结果与之前alkbh10b-1表型一致。

总结

这篇文章详细阐述了去甲基化酶介导的m6A修饰可以维持与花期相关基因的mRNA稳定性，从而影响下游通路基因功能，为植物发育的研究提供了新思路。

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