lincRNA1281上m6A修饰影响胚胎干细胞分化 | m6A专题

文章信息

论文标题：N6-Methyladenosine modification of lincRNA 1281 is critically required for mESC differentiation potential

刊登日期：2018年02月

发表杂志：Nucleic Acids Research

影响因子：10.1

研究机构：上海同济大学康九红课题组

摘要

2018年5月，NAR杂志在线发表了同济大学生科院康九红教授课题组关于lncRNA上m6A修饰的相关研究。目前m6A的研究，大多数仍然集中在mRNA，而lncRNA和circRNA方面关于m6A的研究仍然偏少。关于circRNA上m6A的研究2017年3月曾发表在Cell Research杂志上（pubmed id：28281539），那项研究中也有circRNA研究领域的大牛夫妇陈玲玲和杨力亲自参与。

在本论文中，linc1281以ceRNA吸附let-7家族miRNA机制，调控着小鼠胚胎干细胞mESC的分化过程，进一步的研究发现lincRNA存在RNA甲基化的修饰，这影响了lincRNA的表达水平，从而参与调控mESC的分化进程。这项工作如果单独拆开来都不具有任何创新点，无论是linc1281还是let-7，已经是被无数课题组“玩烂”的老梗，但是与m6A这个当红炸子鸡结合在一起，使得整项工作脱离了老玩法，开始从另一个新颖的角度来解释问题。

流程图

Linc1281对mESC分化至关重要

作者使用qPCR检测后发现，mESC和Lif2、Lif4相比，无论是linc1281还是Mesc特异性基因Oct4和Nanog，表达量显著上调。FISH探针定位表明，linc1281主要集中在胞浆。

作者在mESC中使用两种不同的shRNA敲低linc1281，降低了其85%转录水平，然而干细胞自我更新能力及相关基因Oct4、Sox2和Nanog的表达量都没有发生显著变化。这表明linc1281可能并不影响干细胞的自我更新，而是影响其他功能。

为了研究linc1281是否影响到了干细胞的分化能力，作者将linc1281敲低的细胞和对照组细胞分别注射进免疫缺陷小鼠。尽管小鼠体内都形成了肿瘤，结果表明linc1281缺失的细胞注射进小鼠体内后，病灶部位体积更小重量更轻。组织切片分析表明，三个细胞胚层中畸形瘤数量较少。

在linc1281缺陷型细胞中，一系列肿瘤标志物表达量显著降低进一步证实了细胞分化受linc1281影响。

下一步作者选取了两种细胞，即中胚层心肌细胞和外胚层神经细胞来进一步研究linc1281的功能。定量PCR表明敲低linc1281后，mesoderm(Gata4、Mesp1、Cxcr4)，cardiac progenitor(Mef2c、Isl1、Tbx5)和cardiomyocyte marker(Myl2、Myh6、Myl7、 Slc8a1、MHC和cTnT)转录水平显著降低。

在Control组中，从拟胚体EB开始10天或12天后，分别有75%和80%的EB分化成心肌细胞。而在linc1281敲低的细胞系中，只有40%或50%的EB能分化成心肌细胞。免疫染色结果表明，linc1281敲低且发生分化的细胞中cTnT的表达量有所降低。同样在神经细胞中，linc1281缺失使得SOX1表达量降低。

同样，在神经细胞中，linc1281缺失后，诸如Pax6、N-cad、Zfp521等neural markers的表达量也是显著降低。

为了进一步验证linc1281的功能，作者使用CRIPSR-cas9技术对linc1281进行了敲除，并用FISH和qPCR做了验证。与敲低的结果相似，完全敲除的细胞中Oct4、Sox2及Nanog表达量没有发生显著差异，分化能力减弱。

相反过表达linc1281后，细胞分化能力增强，然而一些分化相关的基因markers表达量却差异不大。在拟胚体形成过程中，一些markers诸如Gata4、Mef2c、Myl2等表达量随着时间的推移表达量显著提升。EB分化比例和cTnT阳性细胞数显著增加。

在神经细胞分化实验中，linc1281过表达能够增强神经生成效率。

作者检验了干细胞和分化细胞中linc1281的转录水平后发现，在干细胞中linc1281表达水平较高而在分化后的细胞中则表达水平较低。

最后作者得出结论linc1281缺失能够抑制干细胞的分化，所以linc1281对干细胞分化至关重要。

Linc1281上存在大量m6A修饰

作者使用MeRIP-qPCR检测到linc1281上存在大量m6A修饰。接下来作者敲低了METTL3，linc1281的表达量差异不显著，但是linc1281的m6A修饰水平显著下降。这表明METTL3介导linc1281上发生m6A修饰。

Linc1281上m6A修饰与mESCs分化相关

作者首先通过生信预测在linc1281上找到了3个m6A相关的motif（RRACH）。

作者对linc1281上发生m6A修饰的moitf内A进行点突变或替换，A替换成G或其他碱基。由于小鼠linc1281同源性很差，作者将这些发生突变/替换、野生型及过表达linc1281这几种质粒载体转入HEK293细胞进行验证。绝大部分突变并不会影响linc1281的转录水平。但是linc1281上的m6A修饰水平显著降低。这说明linc1281上的三个motif对于lncRNA整体的m6A修饰至关重要。

同时作者还将他人已发表的m6A测序数据拿过来重新分析了一次，使用IGV软件也得出了同样的结论，即在3个Motif区域存在高reads富集。

为了证实带m6A修饰的linc1281与干细胞分化之间的关系，作者分别在linc1281敲低的细胞中过表达野生型linc1281，A-G突变的linc1281（m6A修饰缺失）及带m6A修饰NC突变等各种排列组合类型。RT-qPCR表明sh1281+linc1281细胞株拟胚体分化最为显著，因为一些cardiomyocyte markers如Myl2以及cTnT阳性细胞数量等也显著提高。相反的是A-G突变细胞株在心肌细胞分化上不显著。

除心肌细胞外，sh1281+linc1281能够显著促进神经形成。当然无论是sh1281+linc1281还是sh1281+A-G mutant，linc1281本身的转录水平差异不显著。

同样linc1281但不是A-G mutant能够恢复linc1281 knockout干细胞分化能力。

因此作者推测两种细胞系之间的差异可能与linc1281的转录水平/丰度相关。将这个结果与linc1281上m6A修饰水平相关联，即NC mutant带有m6A修饰后，linc1281缺陷的干细胞分化能力得到恢复，作者得出结论linc1281上的m6A修饰和干细胞分化相关。

mESCs中linc1281对let-7有竞争结合作用

通过miranda软件预测了linc1281与let-7家族互作。下一步作者在细胞核和胞浆中检测了let-7的表达水平。与前面的结果一起证实了，let-7和linc1281在胞浆中丰度较高。

作者构建了linc1281全长+报告基因表达载体，并和miRNA mimics一同转入细胞中。与空白mimics对照相比，miRNA mimics能够显著降低linc1281报告基因荧光强度。下一步作者对linc1281上与let-7结合区域大约7bp进行突变。结果表明野生型比突变型荧光强度显著降低。

构建MS2bp-YFP-linc1281共表达载体，与let-7 mimics一起转入HEK293细胞，使用MS2bp-Renilla作为对照。下一步使用YFP-RIP-qPCR，并用IgG作为RIP-qPCR的对照。同样在mESC中也进行了相似的实验，结果表明let-7能够与linc1281直接相结合。

在linc1281敲除和敲低的细胞系中，let-7的表达量显著提升，这表明let-7与linc1281表达量呈现负相关。此外随着let-7表达量提升，let-7靶基因Lin28 RNA结合蛋白表达量显著降低。

综上所述，linc1281对let-7具有竞争结合作用，行使ceRNA功能。

m6A修饰linc1281介导ceRNA调控机制

为了继续深挖linc1281上m6A修饰与miRNA之间的互作关系。作者分别在sh1281+linc1281、sh1281+A-G mutant、sh1281+NC mutant等干细胞中检测let-7的表达水平。结果表明，与sh1281+FlucC相比，sh1281+linc1281和sh1281+NC mutant中let-7表达量显著降低。

然而尽管各个处理的细胞系中，linc1281转录水平差异不显著，但是sh1281+A-G mutant中let-7依旧维持较高的表达水平。因此作者推测linc1281上的m6A修饰可能与let-7互作相关，并对METTL3进行敲低。之后再转入linc1281 reporter和let-7 mimics。

在control细胞系中，荧光信号强度显著降低，这个结果与先前的结果相吻合。但是METTL3敲低后，荧光信号并没有显著差异。

作者过表达WT METTL3和核心催化domain有突变的Mut METTL3，linc1281表型被WT METTL3补救但是Mut METTL3没有影响。接下来在METTL3敲低的NIH/3T3细胞中转入WT METTL3和Mut METTL3并检测荧光信号强度。结果表明只有METTL3敲低的细胞株中WT METTL3才补救回了表型。最终作者认为linc1281上的m6A修饰是与let-7互作的关键因素。

小插曲：相信大家看到这里，即作者直接得出METTL3介导linc1281上的m6A修饰将有助于与let-7互作，心中肯定会升起无数的疑问。实际上，针对这个结论，作为一名深挖漏洞和钻牛角尖的小编也是跟大家一样的。联川生物的客户早在2015年就已经在Nature上证实METTL3会介导miRNA加工（Nature：m6A调控miRNA初级体识别加工 | RNA甲基化套路解读）。RNA甲基化m6A水平增加会使得miRNA成熟体增加。

所以这里作者过表达METTL3使得表型被补救，并没有证实linc1281与let-7的结合（即荧光信号减弱）直接与m6A相关，这里小编认为只是证明了相关性并没有因果性。这里如果能够在体外，用带m6A修饰的linc1281证明能够与let-7互作，这个实验才能彻底坐实作者的猜测。这就减少了由于METTL3过表达导致let-7成熟体表达量升高带来的“干扰”。

但是大家不要着急，这个实验并没有完，小编在这里提出疑问………是想教会和引导大家如何从深度思考实验，而不是仅仅浮于表面。很多高分文章里面也是“漏洞百出”，大家一定要学会批判思维，用辩证的角度做到对论文的细读和精读。

带着上面小插曲中提到的疑问，作者也紧接着提出了这个问题，为了排除因为METTL3引起整体m6A水平异常的可能性，在细胞中分别转入了带m6A修饰和不带m6A修饰的linc1281+荧光报告载体及let-7 mimics。结果表明在带m6A修饰的细胞中，荧光信号强度明显减弱而在不带m6A修饰的细胞中则差异不显著。

与作者预期相符的是，let-7对不带m6A修饰及其他mutant具有负调控作用。

接下来在细胞中分别转入shcontrol和shMETTL3，其他的几种类型如NC、A-G mutant与let-7 mimics共转等实验均表明没有任何差异。所以这些才正式坐实linc1281上的m6A修饰与let-7互作至关重要。

Let-7/Lin28通路能补救非m6A修饰的linc1281导致的细胞分化异常

在最后一个实验中，作者为了证实m6A修饰的linc1281参与let-7的ceRNA竞争结合互作能够直接调节下游的Lin28基因，从而导致干细胞分化异常。

作者先在linc1281缺陷的细胞中转入人工的let-7吸附海绵，人为降低let-7的表达水平，使得干细胞表型得到补救。下一步作者又对linc1281缺陷的细胞中过表达Lin28，最后细胞表型也得到了补救。

总结

小鼠干细胞中linc1281上携带有m6A修饰能够促进与let-7的互作和结合，let-7降低使得Lin28蛋白表达量增加，进而促进干细胞的分化。这项工作中有个细节差点因为没处理好而引来争论，那就是究竟是METTL3本身引起miRNA表达量升高从而导致与linc1281互作几率增加，还是直接由m6A修饰引起的，作者给出了经济成本的解决方法。也相信通过这篇文章，大家可以看到目前学术界为数不多的从lncRNA的角度来把一篇m6A的文章做深。

其实这篇文章并没有太多让人惊艳的亮点，无论是linc1281还是let-7和Lin28，对于学科内的老师来说，都是熟的不能再熟的“老朋友”，这种蹭明星分子和已报到通路的做法，在今后的其他研究方向还会不断地出现。已经玩过的花样，如果能从新的角度例如m6A、m1A甚至是hm5C、乙酰化等方向出发，说不定会有新的惊喜。完全创新成本过高，不如考虑下这种低成本的“创新”方法。

参考文献

Yang D, Qiao J, Wang G, et al. N6-Methyladenosine modification of lincRNA 1281 is critically required for mESC differentiation potential.[J]. Nucleic Acids Research, 2018(Suppl. 1).

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