研究lncRNA的常见技术及原理 | LncRNA专题
本期专题将围绕lncRNA的常见技术与原理，主要介绍RT-PCR/qPCR/RT-qPCR/QD-FISH原位杂交技术/cDNA 末端快速扩增/RNA pull down/RIP技术/ChIRP等技术及原理，还介绍了相关研究思路。
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RT-PCR（reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-PCR），由一条RNA单链转录为互补DNA（cDNA）称作“逆转录”，由依赖RNA的DNA聚合酶（逆转录酶）来完成。随后，DNA的另一条链通过脱氧核苷酸引物和依赖DNA的DNA聚合酶完成，随每个循环倍增，即通常的PCR。原先的RNA模板被RNA酶H降解，留下互补DNA。
RT-PCR的指数扩增是一种很灵敏的技术，可以检测很低拷贝数的RNA。RT-PCR广泛应用于遗传病的诊断，并且可以用于定量监测某种RNA的含量。
RT-PCR的关键步骤是在RNA的反转录，要求RNA模版为完整的且不含DNA、蛋白质等杂质。常用的反转录酶有两种，即鸟类成髓细胞性白细胞病毒（avian myeloblastosis virus，AMV）反转录酶和莫罗尼鼠类白血病病毒（moloney murine leukemia virus，MMLV）反转录酶。
Real-time-PCR和 qPCR（Quantitative Real-time-PCR）是一码事，都是实时定量PCR，指的是PCR过程中每个循环都有数据的实时记录，因此可以对起始模板数量进行精确的分析。
RT-qPCR（Real-time Quantitative PCR），实时荧光定量PCR 就是在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR扩增反应中每个循环扩增产物量的变化，最后通过Ct值和标准曲线的分析对起始模版进行定量分析的方法。
一般分为两类，一类为染料类，包括如SYBR Green I、Eva Green等，通过荧光染料来指示产物的增加；一类为探针类，包括TaqMan探针和分子信标探针等，利用与靶序列特异杂交的探针来指示扩增产物的增加。
SYBR Green I是一种结合于双链DNA小沟中的染料。与双链DNA结合后，其荧光大大增强，这一性质使其用于扩增产物的检测非常理想。SYBRGreen I的最大吸收波长约为497nm ，最大发射波长约为520nm。在PCR反应体系中，体系中的SYBR Green荧光染料掺入DNA双链后发射出荧光，并且荧光的强度与体系中双链的浓度成正比，从而保证了荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步，荧光的强度就代表了体系中双链产物的浓度。
优点：成本低，不需要探针；准备时间和实验时间短，操作简单；可以制作熔解曲线来确定PCR产物是否特异、有无引物二聚体。
缺点：无法多重检测，只能检测一个目标基因；无模板特异性，只能给出总信号，对引物的特异性要求较高；灵敏度低，目的片段需在5000拷贝以上。
应用：一般应用于相对定量分析。最适合初步筛查，即先用SYBR Green方法筛查，得到初步结果后再用TaqMan精确定量
原理为PCR扩增时加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸：5’端标记一个报告荧光基团，3’端标记一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收，不会检测到荧光；PCR扩增时，Taq酶的5'－3'外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号。每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，也同样实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。
优点：特异性高，探针提供了额外的特异性；准确性高，可给出特异模板的荧光信号；可应用于多重定量。
缺点：成本较高，合成探针费用较贵，等待时间长。
应用：一般应用于绝对定量分析，MGB探针等可应用于SNP的检测。
基本原理：被检测的染色体或DNA纤维切片上的靶DNA与所用的核酸探针是同源互补的，二者经变性-退火-复性，即可形成靶DNA与核酸探针的杂交体。将核酸探针的某一种核苷酸标记上报告分子如生物素、地高辛，可利用该报告分子与荧光素标记的特异亲和素之间的免疫化学反应，经荧光检测体系在镜下对待测DNA进行定性、定量或相对定位分析。
优势：①安全、快速、灵敏度高；②探针能较长时间保存；③多色标记，简单直观；④可用于中期染色体及间期细胞的分析；⑤可应用于新鲜、冷冻或石蜡包埋标本以及穿刺物和脱落细胞等多种物质的检测。
应用：① 已知基因或序列的染色体定位；② 未克隆基因或遗传标记及染色体畸变的研究。
cDNA 末端快速扩增 (rapid amplification of cDNA ends,RACE)【参考文献：Rapid Amplification of cDNA Ends (RACE).pdf】
RACE技术是一种基于mRNA反转录和 PCR技术建立起来的、以部分的已知区域序列为起点,扩增基因转录本的未知区域,从而获得mRNA(cDNA)完整序列的方法。简单的说就是一种从低丰度转录本中快速增长cDNA5’和cDNA3’末端，进而获得获得全长cDNA简单而有效的方法，该方法具有快捷、方便、高效等优点,可同时获得多个转录本。因此近年来RACE技术已逐渐取代了经典的cDNA文库筛选技术,成为克隆全长cDNA序列的常用手段。
RACE 是采用PCR 技术由已知的部分cDNA 顺序来扩增出完整cDNA5’和3’末端,是一种简便而有效的方法, 又被称为锚定 PCR (anchoredPCR)和单边PCR(one2side PCR)。
利用mRNA的3'末端的poly（A）尾巴作为一个引物结合位点，以连有SMART寡核营酸序列通用接头引物的Oligo（dT）30MN作为锁定引物反转录合成标准第一链cDNA.然后用一个基因特异引物GSP1（gene specific primer，GSP）作为上游引物，用一个含有部分接头序列的通用引物UPM（universal primer，UPM）作为下游引物，以cDNA第一链为模板，进行PCR循环，把目的基因3' 末端的DNA片段扩增出来。
先利用mRNA的3'末端的poly（A）尾巴作为一个引物结合位点，以Oligo（dT）30MN作为锁定引物在反转录酶MMLV作用下，反转录合成标准第一链cDNA.利用该反转录酶具有的末端转移酶活性，在反转录达到第一链的5'末端时自动加上3-5个（dC）残基，退火后（dC）残基与含有SMART寡核苷酸序列Oliogo（dG）通用接头引物配对后，转换为以SMART序列为模板继续延伸而连上通用接头（见Figure 2 ）。然后用一个含有部分接头序列的通用引物UPM（universal primer，UPM）作为上游引物，用一个基因特异引物2（GSP 2 genespecific primer，GSP）作为下游引物，以SMART第一链cDNA为模板，进行PCR循环，把目的基因5'末端的cDNA片段扩增出来。最终，从2个有相互重叠序列的3'/ 5'-RACE产物中获得全长cDNA，或者通过分析RACE产物的3'和5'端序列，合成相应引物扩增出全长cDNA。
RNA pull down（鉴定与目的lncRNA结合的蛋白配体） 技术是检测 RNA 结合蛋白与其靶 RNA 之间相互作用的重要实验手段。利用体外转录法标记生物素 RNA 探针，然后与胞浆蛋白提取液孵育，形成 RNA-蛋白质复合物。该复合物可与链霉亲和素标记的磁珠结合，从而与孵育液中的其他成分分离。复合物洗脱后，通过 Western Blot 实验检测特定的 RNA 结合蛋白是否与 RNA 相互作用。
赛默飞世尔推出的Pierce Magnetic RNA-Protein Pull-Down Kit试剂盒原理图
试剂盒利用T4 RNA连接酶将单个脱硫生物素化的胞苷二磷酸连接到单链RNA的3’端。3’端的末端标记不干扰RNA结构，因此，比标记核苷酸的随机掺入更加理想。每个标记反应适合50 pmol RNA；不过，如有必要的话，标记反应也可扩展（从1 pmol到1 nmol）。标记反应需要20倍过量的脱硫生物素化核苷酸。对于不太复杂的RNA，孵育时间可为37°C 30分钟，若是更长或更复杂的RNA，时间也延长到4-16°C过夜。通过改变RNA与核苷酸的比例，延长孵育时间，或在标记反应中添加DMSO，可优化复杂RNA的标记效率。
RBP的富集过程经过优化，相当简单。首先将RNA与链霉亲和素磁珠结合。之后在蛋白质-RNA结合缓冲液中平衡RNA结合的磁珠，再加入蛋白裂解液。随后添加适当的缓冲液、涡旋振荡，并在磁力架上分离，洗涤磁珠。最后样品可通过非变性的生物素洗脱缓冲液或SDS-PAGE上样缓冲液洗脱，用于下游分析（如Western blotting和质谱（MS））。
RIP技术（RNA Binding Protein Immunoprecipitation，RNA结合蛋白免疫沉淀）是研究细胞内RNA与蛋白结合情况的技术。运用针对目标蛋白的抗体把相应的RNA-蛋白复合物沉淀下来，然后经过分离纯化就可以对结合在复合物上的RNA进行分析；即用抗体或表位标记物捕获细胞核内或细胞质中内源性的RNA结合蛋白，防止非特异性的RNA的结合（RIP反应体系中的试剂和抗体绝对不能含有RNA酶，抗体需经RIP实验验证等等），免疫沉淀把RNA结合蛋白及其结合的RNA一起分离出来，结合的RNA序列通过microarray（RIP-Chip），定量RT-PCR或 高通量测序（RIP-Seq）方法来鉴定。是了解转录后调控网络动态过程的有力工具，能帮助我们发现miRNA的调节靶点。
CHIRP-Seq 是一种检测与 RNA 绑定的 DNA 和蛋白的高通量测序方法。采用生物素和链霉亲和素探针把目标 RNA 拉下来后，则与其共同作用的 DNA 染色体片段就会附在磁珠上，最后把染色体片段做高通量测序，就会得到该RNA能够结合在基因组的哪些区域；如果结合物是蛋白质，可以将蛋白质打断成肽段进行质谱鉴定。
ChIRP( Chromatin Isolation by RNA Purification )，针对每个特定的lncRNA分子序列，按照100nt的步长设计长度为20个碱基长度的特异性反义核酸序列，并对所有序列进行编号，以奇数为一组，偶数为一组，合成末端修饰Biotin-TEG基团的lncRNA ChIRP probe。lncRNA ChIRP probe与交联的lncRNA分子复合物进行特异性杂交结合，通过末端修饰Biotin-TEG化学基团，利用链霉亲和素偶联的磁珠进行结合，纯化出目标lncRNA所结合的染色质复合体，最后从复合体中纯化出RNA、DNA和蛋白质用于后续的分析，以发现目标lncRNA的分子作用机制。【参考文献：chirp.pdf】
利用 RT-PCR 或者 RT-qPCR 检测 lncRNA 在不同细胞或者组织中的表达水平。
（1）通过 QD-FISH 原位杂交技术定位；或者通过细胞核质分离试剂盒得到 RNA，qRT-PCR 检测其分布；
（2）全长序列试验方法：通过 5′RACE 获取 lncRNA5′ 全长， 3′RACE 获取 lncRNA3′ 全长，最终得到 lncRNA 完整的全长序列。
lncRNA 较长，承载的信息量多，更容易形成高级结构，其功能具有多样化和特异性强的特点。类似于 miRNA，探讨 lncRNA 功能可用 gain/loss of function 策略，过表达或沉默 lncRNA 后观察表型。即研究 lncRNA 功能获得后或者功能缺失后对细胞增殖、凋亡、侵袭、转移与克隆形成，以及病毒的转录复制等的影响。
（1）功能获得性研究
构建 lncRNA 过表达质粒或者慢病毒、腺病毒包装载体。原则上是将全长 lncRNA 定向克隆到表达载体上实现 lncRNA 的过表达。然而有些 lncRNA 很大或全长尚未分离，这时将视 lncRNA 在基因组上的定位采取不同的研究策略。在构建 lncRNA 表达质粒时，需关注 lncRNA 是否在蛋白编码基因的启动子区域或 3′-UTR 区域，勿遗漏重要区段。
（2）功能缺失性研究
可用 siRNA、shRNA、反义核酸、CRISPR/Cas9 等方法沉默 lncRNA，经 qRT-PCR 或 FISH 等验证后观察其对疾病相关基因表达和对细胞表型等的影响。
lncRNA 可与蛋白质、DNA 和 RNA 相互作用，但是目前最常用的还是利用体外转录、RNA pull down、RNA-RIP（RNA Binding Protein Immunoprecipitation）、CHIRP-seq（Chromatin isolation by RNA Purification）、MS 等技术手段。
将 lncRNA 表达与其他领域相结合，解释其调控机理。（1）DNA 甲基化和乙酰化：可通过检测相应基因甲基化、乙酰化差异与 lncRNA 结合分析。（2）转录因子：研究 lncRNA 与转录因子的调控机制。
有条件的实验室，可以继续在体内或者临床样本水平进行验证。
lncRNA的作用机制不清楚，lncRNA 的功能非常难研究。当前很多通过研究 miRNA 与 lncRNA 的调控关系来揭示非编码 RNA 的功能，最热门的要数 ceRNA 调控网络。相关的可利用资源包括：
（1）starBase 平台构建了最全面的 CLIP-Seq 实验支持的 miRNA 和 lncRNA 的调控关系网络，包括构建了 ceRNA 调控网络 。
（2）DIANA-LncBase 数据库 只是构建了基于单个 CLIP-Seq 数据的 miRNA 和 lncRNA 调控关系。
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