为什么要做绝对定量测序-数据分析2

绝对定量测序热度持高，但是，为什么要做绝对定量测序呢？上期为大家解读了绝对定量测序的数据分析（点此查看），今日小编为大家友情解读第二篇绝对定量测序的数据分析，话不多说，进入正题：

上篇软文我们提到，不管是转录组测序还是miRNA测序，当使用常规去除PCR Duplication（mapping coordinates）方法，由不同cDNA（同一条转录本的多个表达拷贝）产生的相同reads会被错误的当成PCR Duplication，使得阳性数据被丢弃掉，造成PCR Duplication，或者说转录本表达量低估：

转录组测序中使用mapping coordinates法，16.4–44.5%的reads被认定为PCR Duplication，而UMI方法只有1.89–10.67%被认为是PCR Duplication，高估率达到几百上千倍。而在miRNA测序中，mapping coordinates法认定的PCR Duplication数据比例达到了56.0–76.8%，而使用UMI方法分析得到的PCR Duplication比率只有1.05–13.6%，二者相比最低相差也达到千倍。

通过上面数据对比可以看出，不管转录组测序还是miRNA测序，大部分序列一致的reads并不是PCR Duplication产生，而是真实的转录产物，联想到miRNA由基因组的很小部分区域转录，数据比对时多条miRNA同时mapping到相同的位点，因此使用mapping coordinates时更容易被错误的认定为更容易去除PCR Duplications。此外，随着测序成本下降，无论转录组测序还是miRNA测序，测序数据量都在提高，不同cDNA产生相同reads的概率也会提高，也说明数据量不是越高越好（RNA测序中增加数据真的那么重要吗）。

下图展示了常规mapping coordinates法和UMI法去PCR Duplications对不同转录本的影响，可以明显看到，119个转录本明显长度更短（median length = 602 nt）、表达量更高（median abundance = 200 FPKM），而其他转录本的median length和median abundance分别是1620和13.2，常规方式使得119个转录本过多reads被认为成PCR Duplications，表达量被低估例 1.25倍。

从这两篇数据分析角度的软文我们可知，虽然常规转录组和miRNA测序也有去PCR Duplication的操作，但是其采用的mapping coordinates的方法容易将真实表达的数据错误的归为PCR Duplications（miRNA测序中情况尤为严重），导致最终分析得到的转录本表达量被低估（更容易影响高表达和长度短的转录本）。

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