iTRAQ/TMT最多只有10标，可我有25份样本怎么办？

iTRAQ/TMT不只是标签不够用

你是否还在纠结iTRAQ/TMT标记定量的标签数不够多，做超过10个样本时该如何设计方案，又或困扰于Label free槽糕的技术重复性。这两类蛋白质组定量技术都有一个共同点，它们都是基于数据依赖采集模式（Data-Dependent Acquisition, DDA）来采集蛋白质谱数据。尽管DDA数据采集模式已有较多应用，然而在实践中也暴露出许多不足，比如重复性、数据缺失、低丰度蛋白检测等。

DIA技术——更优的蛋白定量技术

如果有一种定量技术能够将样本的蛋白质组信息完整保留下来，并且你还能将不同时间采集的样本数据放在一起比较分析或是对数据再挖掘，你信吗？数据非依赖采集(Data-Independent Acquisition，DIA)技术就是满足这种要求的蛋白质组定量技术，曾被《Nature Methods》评为2015年最值得关注的技术之一，既能实现高通量又能达到重复性高、数据覆盖全、并且还能精准定量(Gillet LC, Mol Cell Proteomics, 2012)。

图1 Ruedi Aebersold教授发明了蛋白质组DIA技术

DIA技术不使用同位素标签，实验中将质谱整个全扫描范围分为若干个窗口，高速、循环地对每个窗口中的所有离子进行选择、碎裂、检测，因此实现无遗漏地获得样本中所有离子的全部碎片信息，数据利用度大大提高，缺失值大幅减少（见图2）。相比于iTRAQ/TMT技术，DIA技术更适合于大样本量、复杂体系的蛋白质组定量检测。不论是25份样本还是100份样本的定量分析，都能轻松驾驭。

图2 DDA与DIA实验原理比较

DIA技术具有哪些优势

相比于传统DDA技术，DIA技术具有以下优势：

1) 全景式扫描，无偏好地获得所有肽段的信息，不会丢失低丰度蛋白信息，数据利用度和重复性大幅提高（见图3）；

2)定量准确性更高，避免标记和液相分组引入的实验误差；

3) 数据可以回溯和反复使用；

4)非常适合大样本量的蛋白质组研究。

图3 DIA(左)与DDA(右)数据重复性比较(Bruderer R, et al. Molecular & Cellular Proteomics, 2015)。DIA数据完整性为98%，DDA数据完整性为49%。

这么优秀的技术背后有一套软硬件的支持。DIA数据采集，依赖于质谱仪的扫描速度和分辨率，需配备高性能质谱仪（如Q Exective HF）；DIA的数据采集模式，会产生大量的数据，给分析带来一定的难度，需要使用DDA方法建立library，辅助样本的蛋白质鉴定；同时，需要使用专业分析软件（如Spectronaut）才能很好地解析复杂数据。

DIA一些代表性研究

① l Ben C Collins, et al. Multi-laboratory assessment of reproducibility, qualitative and quantitative performance of SWATH-mass spectrometry. Nature Communications, 2017,8(1):291.

在全球11家质谱实验室，采用相同的实验和分析流程，对SWATH技术（DIA技术的一种）进行综合评估。发现DIA定量蛋白质组学数据都有非常好的重现性和可靠性。

② l Muntel J, et al. Advancing Urinary Protein Biomarker Discovery by Data-independent Acquisition on a Quadrupole-Orbitrap Mass Spectrometer. Journal of Proteome Research, 2015, 14(11):4752-62.

对87份腹痛小儿的尿液样本分别进行DIA检测和DDA检测，全方位比较DIA和DDA的鉴定结果，并利用DIA检测技术筛选疾病biomarker。

③ l Bruderer R, et al. Extending the Limits of Quantitative Proteome Profiling with Data-Independent Acquisition and Application to Acetaminophen-Treated Three-Dimensional Liver Microtissues. Molecular & Cellular Proteomics, 2015, 14(5):1400.

DIA技术应用于乙酰氨基酚处理的三维肝脏显微组织的蛋白质组定量研究。

推荐阅读