ACY-1215通过miR-30d/PI3K /AKT/mTOR和ERK途径抑制食管鳞状细胞癌的增殖并促进细胞凋亡 | 案例分析

文章信息

Ricolinostat（ACY-1215）通过miR-30d/PI3K /AKT/mTOR和ERK途径抑制食管鳞状细胞癌的增殖并促进细胞凋亡

Ricolinostat (ACY-1215) suppresses proliferation and promotes apoptosis in esophageal squamous cell carcinoma via miR-30d/PI3K/AKT/mTOR and ERK pathways

发表单位：浙江大学医学院附属第一医院

发表期刊：Cell Death & Disease

影响因子：5.638

技术手段：miRNA芯片

研究背景

食道癌是世界上最具侵袭性的恶性肿瘤之一。食管癌的两种主要组织病理学类型是鳞状细胞癌和腺癌。最近，靶向治疗在各种癌症中发展迅速；然而，目前只有曲妥珠单抗（靶向HER2）和雷莫芦单抗（VEGFR-2抑制剂）被国家综合癌症网络推荐用于治疗食管癌患者。因此，迫切需要阐明食道癌潜在发病机理和鉴定有效生物制剂。

HDAC6（组蛋白脱乙酰基酶6）是一种具有两个脱乙酰酶结构域的独特同工酶，属于IIb类组蛋白去乙酰化酶家族。该酶通过调节许多生理或病理过程的脱乙酰酶依赖性或脱乙酰酶非依赖性机制参与多种功能。目前已找到一些选择性HDAC6抑制剂，某些抑制剂对HDAC6表现出极高的选择性，并在癌症治疗中显示出广阔的应用前景。

Ricolinostat（ACY-1215）是非常有效和选择性HDAC6抑制剂，已经证明单独或与其他药物联合应用于各种癌症中的抗肿瘤作用，如多发性骨髓瘤，淋巴瘤，胶质母细胞瘤，黑色素瘤等。一项多中心1b期临床试验发现ACY-1215是一种安全且耐受良好的选择性HDAC6抑制剂，与来那度胺和地塞米松联合应用于复发或难治性多发性骨髓瘤。然而，其在食管癌中的功效和机制仍不清楚。

研究方法

本研究对参与ACY-1215抑制肿瘤细胞增殖的基因、miRNA及相关蛋白等进行了分析，研究了ACY-1215抑制肿瘤细胞增殖的信号通路，并通体内外实验得到验证。

取材：46份人体ESCC标本组织，多种肿瘤培养细胞

研究结果

1. HDAC6的高表达与预后不良有关

HDAC6与ESCC之间相互关系的机制尚未被揭示。本研究首先使用qRT-PCR分析来鉴定46个人ESCC标本中HDAC6的表达。中位随访时间为31个月（范围2-48个月）。根据最佳截断分析，HDAC6相关mRNA水平分为低表达（≤1.85）和高表达（> 1.85）。与低表达相比，HDAC6的高表达与不良预后相关（p=0.0011图1a）。

Fig. 1 The high expression of HDAC6 was associated with poor prognosis in ESCC specimens, and ACY-1215-inhibited tumor cell proliferation

2.ACY-1215抑制细胞增殖并引起G2/M阻滞和细胞凋亡

为了研究HDAC6抑制剂在ESCC中的抗肿瘤作用，对EC109，KYSE150，TE-1和TE-13细胞进行ACY-1215处理，检测其对细胞增殖的作用。MTT测定显示ACY-1215以剂量和时间依赖性方式抑制细胞增殖（图1b）。研究还使用qRT-PCR分析来比较这些ESCC细胞与正常HUVEC细胞中HDAC6的表达。发现所有ESCC细胞系中HDAC6表达的相对水平高于HUVEC细胞（图1c）。此外，使用ACY-1215处理抑制HUVEC细胞的增殖。MTT测定显示，ACV-1215抑制HUVEC的细胞增殖显著低于ESCC细胞（图1d）。

为了阐明ACY-1215抑制肿瘤细胞增殖的机制，检测了不同剂量下的细胞周期进程和细胞凋亡。结果观察到G2/M阻滞，G2/M期细胞积聚和G1期减少是以剂量依赖性方式发生的（图2a，c）。G2 / M细胞周期调节蛋白，如存活蛋白，CDC2，P-P53和细胞周期蛋白A2，均响应ACY-1215处理而下降，而P21蛋白表达增加（图2b，d）。

 Fig. 2 ACY-1215 treatment induced G2/M-phase cell cycle arrest

接下来的研究评估了ACY-1215对细胞凋亡的影响，发现凋亡细胞的比例以剂量依赖性方式显著增加（图3a，c）。为了鉴定可以介导这种作用的凋亡调节蛋白，使用蛋白质印迹分析来筛选ACY-1215处理后改变的蛋白质。该处理增加了Bax，Bim，cleaved caspase 3 和9以及cleaved PARP蛋白的表达，并降低了Bcl2蛋白的表达（图3b，d）。

 Fig. 3 ACY-1215 treatment induced tumor cell apoptosis

3.ACY-1215抑制PI3K/AKT/mTOR和ERK信号传导并增加核内组蛋白表达
为了更好地了解ACY-1215导致肿瘤细胞周期阻滞和凋亡的机制，利用Western blot检测ACY-1215对其他靶点的作用。结果表明ACY-1215有效降低PI3K，P-AKT（S473），PRAS40，P-mTOR和P-ERK1/2蛋白水平并增加Rag C蛋白水平（图4a）。此外，使用GSK690693（泛Akt抑制剂）与ACY-1215联合处理ESCC细胞，检测到与GSK690693的共处理可以进一步增强ACY-1215抑制细胞增殖（图4b）。由于阻断AKT下游的负反馈环（PRAS40，Rag C和P-mTOR），GSK690693增加了P-AKT（图4c）。HDAC6在调节许多基因的转录中起着重要的表观遗传作用，通过蛋白质印迹分析提取核蛋白并探索核内组蛋白的表达，发现ACY-1215处理后Ac-H3K9和Ac-H4K8的水平增加（图4d）。

Fig. 4 ACY-1215 inhibited PI3K/AKT/mTOR and ERK signaling and increased intranuclear histone expression

4.ACY-1215促进miR-30d表达且miR-30d直接下调PI3K

在确认ACY-1215与表观遗传效应相关后，使用miRNA芯片分析研究那些ACY-1215处理后表达升高的miRNA，共发现46种候选miRNAs，信号水平至少上升8倍。使用三种公开的预测工具：Targetscan，Pictar和miRanda探索参与PI3K/AKT信号通路的潜在miRNA。结果发现miR-30d直接下调PI3K调节亚基2（PIK3R2）。qRT-PCR验证结果表明在ACY-1215处理后miR-30d显著过表达，而PIK3R2表达降低（图5a,b）。此外，研究发现当用miR-30d抑制剂转染ESCC细胞时，PIK3R2表达显著增加，特别是在ACY-1215处理组中，进一步证实PIK3R2是miR-30d的直接靶基因（图5c,d）。

Fig. 5 ACY-1215 promoted miR-30d expression, and miR-30d directly downregulated PI3K

5.抗miR-30d部分恢复由ACY-1215处理引起的G2/M阻滞和细胞凋亡以及AKT信号传导

为了阐明miR-30d在ACY-1215处理后在ESCC中的潜在功能机制，将miR-30d抑制剂转染到肿瘤细胞中，发现抗miR-30d部分拯救了ACY-1215诱导的G2/M阻滞和凋亡（图  6a-d）。

Fig. 6 Anti-miR-30d partially restored the G2/M arrest and apoptosis and AKT signaling caused by ACY-1215 treatment

蛋白质印迹分析表明ACY-1215诱导的细胞周期调节和凋亡调节蛋白和AKT信号蛋白的表达的变化也被抗miR-30d部分逆转（图7）。总之，这些数据验证了ACY-1215通过上调miR-30d和抑制PI3K/AKT/mTOR信号传导途径抑制增殖并促进ESCC凋亡的结论。

Fig. 7 Cells were treated with Lipofectamine 2000, 50 μM ACY-

1215, and/or 50 nM miR-30d inhibitor for 48 h

6.ACY-1215在小鼠异种移植模型中抑制肿瘤生长

为了进一步验证ACY-1215在体内的作用，将EC109细胞皮下注射到BALB/c裸鼠中。注射10天后，将小鼠分为对照组和ACY-1215处理组，后者通过腹膜内注射ACY-1215 50mg/kg，治疗耐受性良好。在三个治疗周期后，ACY-1215治疗组导致统计学显著的肿瘤生长慢于对照组（图8a-c）。这些发现表明ACY-1215抑制体内肿瘤生长。

Fig. 8 ACY-1215 treatment led to significant tumor growth slowed in vivo

研究结论

本研究评估了ACY-1215在ESCC中的功效和潜在机制。研究发现HDAC6在ESCC中起着致癌基因的作用。ACY-1215抑制ESCC增殖，引起G2 / M期阻滞和凋亡。本研究整合了HDAC6的表观遗传特征和癌症相关的信号通路，以探索这些功能的潜在机制。有趣的是，本研究进一步的证据表明ACY-1215通过直接影响miR-30d / PI3K / AKT / mTOR和ERK途径触发细胞周期停滞和细胞凋亡。

本研究中的miRNA芯片及其相关分析由联川生物提供技术支持

参考文献

Cao J, Lv W, Wang L, et al. Ricolinostat (ACY-1215) suppresses proliferation and promotes apoptosis in esophageal squamous cell carcinoma via miR-30d/PI3K/AKT/mTOR and ERK pathways[J]. Cell Death & Disease, 2018, 9(8).

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