miRNA怎样蹭上m6A的热点发高分？| m6A专题

距离线虫体内克隆出的第一条miRNA——let-7，已经过去了二十多年。Pubmed上关于miRNA的文章数量每年也是节节攀升。2017年整年发布的关于miRNA的文章数已经达到了10886篇，而截至本稿完成的2018年6月，也有5581篇miRNA的文章发表。

（miRNA论文每年发表数量）

关于miRNA的研究，二十多年以来一直经久不衰，持续不减。但是我们会发现，单纯miRNA机制的研究已经难以发表高水平的论文了。每每大家喊出了miRNA是过气明星的时候，总会借由新的概念起死回生。

2011年，Cell上一篇名为A ceRNA hypothesis: the Rosetta Stone of a hidden RNA language？的文章，带动miRNA迎来了事业的又一春。这篇文章目前被引用数量高达1400次。circRNA及lncRNA通过调控miRNA继而调控下游靶基因，成为全球各大课题组追逐的热点。

同样2013年，随着诺贝尔生理学及医学奖的公布，大家的关注点集中在了细胞囊泡运输机制上，外泌体又将miRNA的研究推向了新的高潮。由于miRNA具有保守稳定等特点，成为诸多临床医学及基础医学研究人员眼中的香饽饽，是biomarker研究的不二之选。

可是在已经是2018年的今天，ceRNA以及外泌体类关于miRNA的文章数量也是“超发”严重，各大实验室竞相灌水，使得类似的套路再也“玩不转”了。投的杂志也是从各大医学杂志的顶级期刊，如Hepatology、European Urology、Clinical Cancer Research、Blood、Circulation沦落到部分低于2-3分的三区四区杂志。

既然miRNA机制被玩烂了，那么做基础的研究一定没机会了吗？也不是！加州大学圣迭戈分校付向东教授于2017年的Nature Structural & Molecular Biology上发表了miRNA加工成熟的新机制。这篇名为NEAT1 scaffolds RNA-binding proteins and the Microprocessor to globally enhance pri-miRNA processing的文章，提出了新型的“鸟巢”模型理论，对原有的miRNA加工机制是一次重要的补充。

这类研究通常属于高度原创，也是烧钱烧时间的劳动密集型工作。通常需要通过Pull-down、Co-IP、RIP-seq及ChIP-seq等手段海量筛选感兴趣的蛋白、RNA或DNA，才能幸运地“猎取”1-2个关键的明星分子往下游深入地做。

付向东老师证明了NEAT1参与pri-miRNA的加工过程。事实也告诉我们NEAT1慢慢地成为了人们眼中的明星分子。Pubmed上关于NEAT1与肿瘤的研究也是持续不减。2017年一共有43篇关于NEAT1的文章发表。

说了那么多，为什么还没有提m6A呢？别急，miRNA能顽强地存活二十多年，一定有他的道理。既然关于miRNA加工还有很多未知的谜底等着我们去揭开，那么同样m6A也与pri-miRNA的加工息息相关。

接下来我们来看看，被大家吐槽无数次过气的miRNA如何蹭上m6A的热点后，发表高分文章。

方向1：m6A修饰调控miRNA成熟体加工

早在2015年，联川生物客户在世界上首次证实miRNA加工与m6A修饰相关。一篇Nature（m6A调控miRNA初级体识别加工）是关于METTL3参与pri-miRNA上的m6A修饰，敲低METTL3影响了pri-miRNA上m6A修饰，继而降低miRNA成熟体表达量。一篇Cell（m6A识别酶HNRNPA2B1介导RNA加工）证实了pri-miRNA上m6A被HNRNPA2B1这个reader识别后激活pre-miRNA加工通路，继而影响成熟体的加工。

需要注意的是，miRNA成熟体的表达量受METTL3或者说受整体m6A水平调控是广谱性的。整体m6A水平降低会影响大量miRNA成熟体的形成。

总之miRNA成熟体的加工与上游的m6A相关，一旦pri-miRNA上m6A修饰降低，miRNA成熟体表达量也是随之降低。

那么既然miRNA加工与m6A有关，后面的文章套路该怎么玩呢？

那就必须祭出我们的大招--明星分子了！我们知道miRNA研究了很多年，其套路已经“深入人心”，该挖的功能也挖了，该做的研究也做了。显然往下游做不太容易，那么往上游延伸则是不二之选。

2017年，二军大东方肝胆的孙树汉课题组在Hepatology上发文，从RNA甲基化的角度切入了miRNA的研究（RNA甲基化转移酶METTL14影响肝癌转移）。

METTL14降低→HCC中m6A水平降低→miR-126表达量降低

从上面这个示意图我们可以看到，miR-126属于已经被研究了很多年的明星分子，具有抑制肝癌细胞增殖、侵袭、转移等功能。一旦m6A水平降低，直接导致miR-126表达量降低，从而促进HCC的增殖与侵袭。作者也在讨论中直接点出了，既然先前的研究是从METTL3的角度来，那么我为什么不能从METTL14的角度来出发呢？所以最后孙树汉课题组直接借鉴了联川生物客户在2015年Nature上的套路，将METTL3直接替换成了METTL14进行后续验证。下图就是论文中作者关于METTL3和METTL14的诸多推测和结论。

方向2：miRNA靶向甲基化酶

这个方向想必是大家头脑中马上会get到的点，但是不幸地告诉大家，如果往这个方向玩命做，也是发表不了高水平的论文的。因为我们知道miRNA抑制靶基因的套路已经被玩了至少十多年了，这种研究会显得很没有诚意和创意。所以往往这类研究可以作为整篇大论文的补充和“配菜”，但是作为“主菜”是万万不可的。

2017年1月，天津医科大学和南开大学两所高校联合在著名的老牌期刊Journal of Biological Chemistry上发表了一篇名为“MicroRNA-145 Modulates N6-Methyladenosine Levels by Targeting the 3’-Untranslated mRNA Region of the N6-Methyladenosine Binding YTH Domain Family 2 Protein”的文章。

在这篇文章中，我们可以从上面的示意图发现，YTHDF2作为reader行使识别带有m6A修饰的mRNA并将其降解的功能。而YTHDF2被miR-145抑制后，mRNA整体的m6A水平发生显著上调。这类工作通常较为严谨，小创意是有的，不过没有大的原创性工作。由于整篇文章工作量也非常大，逻辑性和严谨性都不容置疑，于是还是得到了老牌杂志的青睐。

方向3：lncRNA或circRNA上m6A修饰影响miRNA sponge的ceRNA机制

前面提到的ceRNA机制已经被玩烂了，那么跟m6A联系起来该怎么玩呢？同济大学康九红教授课题组给了他们的答案。在（linc1281上m6A修饰影响胚胎干细胞分化）这篇文章，康九红发现lncRNA上携带m6A修饰能够促进与miRNA结合。

这篇文章里，作者对2个明星分子linc1281和let-7展开了拓展研究。所以有时候面对一大堆目标不知所措时，不妨将已研究的范围缩小到已报道的明星分子上。例如let-7已经被研究很多年了，而linc1281在发育上也不是一个新分子。

但是有个疑问，METTL3的表达量本身就会影响miRNA成熟体的表达量，那么如何排除m6A影响了miRNA加工继而导致lncRNA与miRNA的ceRNA互作降低这个原因呢？

作者分别在sh1281+linc1281、sh1281+A-G mutant、sh1281+NC mutant等干细胞中检测let-7的表达水平。结果表明，与sh1281+FlucC相比，sh1281+linc1281和sh1281+NC mutant中let-7表达量显著降低。

然而尽管各个处理的细胞系中，linc1281转录水平差异不显著，但是sh1281+A-G mutant中let-7依旧维持较高的表达水平。因此作者推测linc1281上的m6A修饰可能与let-7互作相关，并对METTL3进行敲低。之后再转入linc1281 reporter和let-7 mimics。

在control细胞系中，荧光信号强度显著降低，这个结果与先前的结果相吻合。但是METTL3敲低后，荧光信号并没有显著差异。

作者过表达WT METTL3和核心催化domain有突变的Mut METTL3，linc1281表型被WT METTL3补救但是Mut METTL3没有影响。接下来在METTL3敲低的NIH/3T3细胞中转入WT METTL3和Mut METTL3并检测荧光信号强度。结果表明只有METTL3敲低的细胞株中WT METTL3才补救回了表型。最终作者认为linc1281上的m6A修饰是与let-7互作的关键因素。

需要注意的是，上面所有的实验只是证实了相关性，即m6A修饰的lncRNA是与miRNA互作的主要因素。但是如何证明因果性呢？

带着上面小插曲中提到的疑问，作者也紧接着提出了这个问题，为了排除因为METTL3引起整体m6A水平异常的可能性，在细胞中分别转入了带m6A修饰和不带m6A修饰的linc1281+荧光报告载体及let-7 mimics。结果表明，在带m6A修饰的细胞中，荧光信号强度明显减弱而在不带m6A修饰的细胞中则差异不显著。

与作者预期相符的是，let-7对不带m6A修饰及其他mutant具有负调控作用

接下来在细胞中分别转入shcontrol和shMETTL3，其他的几种类型如NC、A-G mutant与let-7 mimics共转等实验均表明没有任何差异。所以这些才正式坐实linc1281上的m6A修饰与let-7互作至关重要。

你get到了miRNA的新玩法了吗，搭上了m6A的顺风车，发高分不是梦，老分子也能焕发新生！

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