重磅 | m6A高分文章的秘密和后期验证工具集锦

很多老师表示，做完了m6A测序，后面该如何展开自己的实验没有头绪。我们在前面已经把一些常规的后期验证工具给大家做了罗列，如双荧光报告、RIP、pull-down、蛋白细胞定位等。没关系，在这里联川生物的小编给大家整理了一系列资料，让我们来看一看高分文章里究竟做了哪些工作。我们会把具体的案例解析带给大家，这样大家可以更加身临其境地了解到这个实验在何种场景下展开。

目前已整理完的内容包括：

（一）队列大样本及临床意义

很多涉及肿瘤、心血管、干细胞发育等方向的文章，除了完善的分子机制验证和动物模型实验外，还会对大样本的病人或动物进行了验证。病人队列的数量从几百人至几千人不等。一些高分文章还会加入典型性病例的case report。

这里要求老师在搜集临床样本的时候，除了数量尽量多之外，样本要有意义和代表性。一些特殊的典型样本是冲击高分文章的不二法宝。

另外，RNA甲基化的一些核心蛋白如Writers、Erasers和Readers要尽量跟临床意义和疾病表型等性状相关联，如肿瘤转移、肿瘤细胞凋亡和耐药性等。

案例1.1：RNA甲基化转移酶METTL14影响肝癌转移（点此查看详情）

在这篇案例中我们可以看到，作者搜集了130例HCC肝癌病人的癌症组织跟癌旁组织，这其中包括发生转移以及门静脉癌栓PVTT等各种比较难以搜集的样本。我们知道门静脉癌栓通常证明肝癌病人已处于中晚期，生存期通常在3个月左右，不会超过半年。样本搜集会比较困难。在这篇文章中，PVTT样本量相对其他一般的论文在数量上要多得多。

作者最后得出结论，PVTT的肝癌病人METTL14表达量显著低于未发生肝转移的病人。作者又对其他容易发生转移的肿瘤如乳腺癌、肺癌等进行了检验，发现METTL14都显著降低。这表明METTL14与HCC的转移相关。

案例1.2：FTO对急性髓细胞白血病有致癌作用（点此查看详情）

作者首先从2000多人的急性髓细胞白血病AML队列的芯片数据中挖掘到，在发生重排的病人中去甲基化酶FTO上调。接下来，作者又亲自使用qPCR和WB验证了大量的病人。

细胞实验证实，FTO过表达后AML两种细胞系mono-mac-6和mv4-11凋亡减少。但是在慢粒细胞K562中无论是敲低还是过表达FTO，细胞表型变化不显著。说明FTO只在AML起作用。

论文通过一系列细胞实验和动物实验，详细阐释FTO介导的ASB2和RARA调控白血病发生和对全反式维甲酸ATRA的耐药机制。也就是首先FTO在AML中具有致癌作用，接下来FTO由于介导ASB2和RARA上的m6A修饰并影响两个基因的转录水平，最后FTO与ATRA的耐药性联系起来。

（二）m6A RRACH motif上的突变点或不带m6A修饰

针对富含m6A修饰的区域，也就是RRACH motif上的腺嘌呤A进行点突变后，进行一系列后续的验证实验。其中包括体外（in vitro）实验、细胞内实验和动物体内实验（in vivo）、双荧光报告实验（ceRNA机制）、GFP报告基因等。另外体外实验除了点突变外，还可以认为合成一段序列，上面的A既可以带m6A修饰也可以不带m6A修饰进行后续实验。

案例2.1：lincRNA1281上m6A修饰影响胚胎干细胞分化（点此查看详情）

在linc1281敲低的细胞中过表达野生型linc1281，A-G突变的linc1281（m6A修饰缺失）及带m6A修饰NC突变等各种排列组合类型。RT-qPCR表明sh1281+linc1281细胞株拟胚体分化最为显著。相反的是A-G突变细胞株在心肌细胞分化上不显著。通常这类实验直接对RRACH motif中的A进行突变观察细胞表型，来证明m6A与表型变化具有相关性。

在细胞中分别转入了带m6A修饰和不带m6A修饰的linc1281+荧光报告载体及let-7 mimics。结果表明在带m6A修饰的细胞中，荧光信号强度明显减弱而在不带m6A修饰的细胞中则差异不显著。这个实验为了证明lncRNA和miRNA的ceRNA机制由m6A介导，这种方法比较直观。

案例2.2：m6A识别酶HNRNPA2B1介导RNA加工（点此查看详情）

在这篇案例中，作者使用了体外（in vitro）实验来验证reader之一的HNRNPA2B1是否能够特异性结合发生RNA甲基化的探针。这里RNA探针都带有同位素标记，最后实验证实HNRNPA2B1只特异性和带有m6A的探针结合，而不会与非m6A修饰的探针及其他碱基修饰的RNA探针相结合。

案例2.3：m6A调控miRNA初级体识别加工（点此查看详情）

为了证明m6A修饰直接参与pri-miRNA的加工过程，作者获得了转染了DGCR8和DROSHA的HEK293细胞提取物。这些提取物被用于验证pri-miRNA是否含有m6A碱基修饰。通过Northern blot实验发现，发生甲基化的pri-let-7比未发生甲基化修饰的pri-let-7通过微处理蛋白复合物作用后产生pre-let-7的效率会更高。

接下来，作者对pri-miRNA上容易发生m6A修饰的腺嘌呤苷酸（位于METTL3 motif中的A）进行点突变。已知pri-let-7e上一共含有五个腺苷酸（A），作者分别将五个A全部进行点突变。实验结果表明，这些被突变的METTL3 motif（也叫作腺嘌呤苷酸A）能够显著降低pri-miRNA加工成熟体miRNA的效率。

案例2.4：METTL3上调肝癌中m6A水平引起YTHDF2介导SOCS2降解（点此查看详情）

已知YTHDF2在Reader家族中行使靶基因降解功能，当与带有m6A修饰的mRNA结合后，靶基因会随之被降解。这篇文章中，作者对SOCS2的序列中RRACH motif内A碱基替换成C，采用荧光素酶报告基因系统验证m6A修饰对SOCS2基因表达量影响。结果表明野生型组中，荧光素酶报告强度显著降低，而发生A-C替换突变组中差别不大。意味着野生型中带有m6A修饰的SOCS2基因会被YTHDF2降解，而METTL3行使的m6A催化功能尤其关键。

案例2.5：FTO对急性髓细胞白血病有致癌作用（点此查看详情）

为了阐释在急性髓细胞白血病AML中FTO调控靶基因分子机制，作者使用m6A qPCR array证实FTO过表达和敲除会分别降低和提升靶基因ASB2和RARA的m6A水平。接下来，作者使用荧光素酶报告基因系统验证了ASB2 3’UTR、RARA 5’UTR和3’UTR能够真的被FTO直接作用。结果表明，当UTR上的m6A motif被突变后，FTO不能与其结合，且FTO被突变后也不能与UTR相结合。

为了证实是否真的与m6A相关，作者分别将ASB2和RARA的UTR载体和发生m6A motif突变的载体转染进293细胞，这些载体上带有荧光素酶报告基因，接着使用m6A qPCR来进行验证。结果表明，FTO作用下未发生突变的UTR其m6A水平显著降低，而无论是发生突变的FTO还是UTR都不能显著降低m6A水平。

案例2.6 YTHDF2介导mRNA降解导致子代斑马鱼发育迟缓（点此查看详情）

为了验证带有m6A修饰的mRNA能够激活YTHDF2的清除功能，作者将GFP荧光蛋白mRNA（分别带有和不带有m6A修饰）注射进入胚胎细胞中并用qPCR验证。结果表明，在野生型胚胎中带有m6A修饰的mRNA被降解的速度更快，在YTHDF2突变型胚胎中，发生m6A修饰的mRNA降解受到影响。相似的实验结果也在MO处理组得到重现。在荧光显微镜下，YTHDF2突变型胚胎中荧光强度显著高于野生型。所有这些结果都表明m6A甲基化会影响靶基因的稳定性，而斑马鱼胚胎中YTHDF2能够直接介导母源mRNA的降解/清除。

（三）点印记法dot-blot assay

与酶标仪相似，点印记法也可以检测整体的甲基化水平。其基本原理是通过特异性抗体对凝胶电泳处理过的细胞或生物组织样品进行着色。通过分析着色的位置和着色深度获得特定蛋白质在所分析的细胞或组织中表达情况的信息。在RNA甲基化中，m6A抗体会与带有m6A修饰的RNA相结合，通过点印记法可以判断m6A修饰水平的高低。此外，点印记法还能使用m6A抗体之外的其他抗体，如甲基化转移酶METTL3 去甲基化酶ALKBH5抗体可以与对应被修饰的RNA相结合，继而判断靶基因丰度的高低。

案例3.1 m6A调节果蝇性别分化和神经功能（点此查看详情）

使用点印记法（dot-plot）和pull down实验表明，果蝇Reader同源蛋白YT521-B能够与RNA上的m6A位点相结合。

（四）RIP-PCR

在前面，我们提过m6A-IP-qPCR，即利用m6A抗体先富集到带有m6A修饰的RNA，然后使用qPCR检测感兴趣的目标基因表达水平。此外，为了在后期证实诸如Writers、Erasers和Readers是否真正调控了靶基因，我们需要做RIP-PCR。老师需要购买这三类甲基化酶的抗体，去富集RNA，然后检测感兴趣的靶基因是否真正被这些酶修饰。如果缺少这个实验，只能从测序证实甲基化酶差异表达与靶基因发生差异甲基化修饰，有相关性而没有因果性。

这部分内容由于已经在RNA甲基化m6A后期验证工具（二）|m6A专题 和 你以为做完m6A测序后就完了？m6A-IP-qPCR了解下！ 做了介绍，在这里不再赘述。

（五）转录抑制剂和m6A甲基化抑制剂

在借助外力的帮助下，一些小分子化合物可以起到抑制转录调控及m6A甲基化修饰的作用。这些小分子或打开激活，或关闭，对于研究者来说非常方便。

案例5.1：METTL3上调肝癌中m6A水平引起YTHDF2介导SOCS2降解（点此查看详情）

在这篇论文中，作者已证实SOCS2作为METTL3的靶基因，其m6A修饰水平与METTL3直接相关。而发生m6A修饰的SOCS2容易被YTHDF2识别，继而被降解。于是作者加入了m6A甲基化抑制剂3‐deazaadenosine后，SOCS2表达量也显著上升。下一步作者挖掘了先前别人文献中已报道的CLIP-seq数据发现YTHDF2能够直接靶向SOCS2。这个结果与作者自己的m6A测序数据也相吻合。因此作者推测SOCS2降解由YTHDF2直接介导。

案例5.2：拟南芥去甲基化酶ALKBH10调控成花转变（点此查看详情）

在哺乳动物中，先前已有大量实验证实YTHDF2作为reader可以对发生甲基化的mRNA进行降解。为了在拟南芥中证实这种猜想，作者开展了两项独立实验来对FT基因在整个生命周期中的降解情况进行实时监控：a. 在转录水平最高的白天Z16期前使用转录抑制剂放线菌素D（actinomycin D）监控FT的转录水平；b. 在夜晚Z16后检测FT的降解水平。两种方法同时证实在alkbh10b-1突变体中FT降解速度比野生型拟南芥更快。这个现象表明，当拟南芥中甲基化水平提升时，mRNA会加速降解。当在alkbh10b-1中进行ALKBH10b过表达时，FT甲基化水平降低，mRNA维持稳定性（即不被快速降解）。

案例5.3 拟南芥m6A甲基化酶FIP37调控茎尖分生组织发育（点此查看详情）

作者为了进一步证实拟南芥中WTAP同源蛋白FIP37是否能够迅速瞬时的影响WUS和STM的m6A水平和转录表达水平，作者构建了类固醇激素诱导FIP37表达的拟南芥株系fip37-4 gFIP37-GR。已知地塞米松（Dexamethasone）是一种成本极其低廉的人工合成皮质类固醇激素。假如fip37-4 gFIP37-GR株系不对其使用地塞米松，其表型性状与fip37-4 LEC1:FIP37相似。使用地塞米松后，fip37-4 gFIP37-GR表型得到补救。

针对5日龄的fip37-4 gFIP37-GR的茎尖组织使用地塞米松处理后4小时，作者发现WUS和STM的mRNA转录水平显著降低，m6A水平显著提升。但是地塞米松并没有影响到CLV3和KNAT1在茎尖组织中的的转录水平和m6A水平。

作者得出结论，FIP37主要在SAM组织中靶向了WUS和STM并介导其mRNA的m6A修饰。

（六）甲基化酶核心domain突变（非人和小鼠物种）

通常甲基化酶都有对应起作用的domain，也叫结构域。这些起到催化作用的结构域一旦被突变，那么酶的催化作用就会丧失。这类实验目前也是十分高频地出现在文章里面。通常这类实验出现的物种不是人和小鼠，因为这两类研究中对应的甲基化酶已经被研究多年，而新的物种无论是植物还是动物，首先第一步要鉴定出甲基化酶，下一步要鉴定其催化的核心结构域就显得至关重要。同源蛋白建模后就能开展类似的工作了，如果突变体不好构建，体外实验也是可以先进行的。

案例6.1：拟南芥去甲基化酶ALKBH10调控成花转变（点此查看详情）

贾桂芳课题组从体外实验和体内实验2个部分，来证实ALKBH10b核心的催化结构域被突变后，其功能遭到了破坏。

体外实验部分：将拟南芥去甲基化酶ALKBH10b行使催化活性关键结构域上的氨基酸残基H366A/E368A进行突变后，ALKBH10b的去甲基化修饰活性被破坏。此外贾桂芳等人还比较了人源ALKBH5在同等条件下与ALKBH10b是否在催化能力上相似。结果表明，ALKBH10b比ALKBH5在催化ssRNA上活性略低，而具有茎环结构的structured RNA两者并无明显差别。另外ALKBH10b只对m6A有特异性去甲基化催化功能，而m1A则没有催化功能。

体内实验部分：为了在拟南芥体内验证ALKBH10b的功能，贾桂芳等人构建了2个突变体：alkbh10b-1（ALKBH10B FeII结合位点前外显子插入T-DNA）和alkbh10b-2（ALKBH10B预测α-KG结合位点前内含子插入T-DNA）。RT-qPCR实验表明alkbh10b-1几乎不产生任何ALLBH10b的转录本，而alkbh10b-2只产生不到5%的转录本。当去甲基化酶ALKBH10b催化功能被破坏后，RNA整体的m6A/A的比例开始升高（即甲基化水平上升）。接下来进行补救实验（rescue）对alkbh10b-1和alkbh10b-2进行了ALKBH10b的过表达实验，拟南芥表型得到补救恢复到野生型但alkbh10b-1补救效果比alkbh10b-2要更优。在野生型中过表达ALKBH10b（35S），甲基化水平也是显著下降。

案例6.2：m6A-YTH组件调控拟南芥叶片发育时间和形态发生（点此查看详情）

通过对人、斑马鱼、拟南芥等物种的甲基化阅读蛋白Reader的二级结构上20个氨基酸残基分析后发现，无论是人还是拟南芥鉴定出共有的m6A结合16个保守残基。部分保守残基如色氨酸（tryptophans）用于形成芳香基口袋，这对m6A RNA的结合至关重要，表明拟南芥阅读蛋白家族ECT2、ECT3、ECT4能够与m6A修饰的碱基直接相结合。

为了进一步探寻甲基化阅读蛋白的特性，作者对人的YTHDF1、拟南芥ECT2/3三种酶的YTH domain构建了3D蛋白结构模型。YTHDF1蛋白晶体结构对于ECT2和ECT3两种酶的结构模拟重建（swiss-model在线功能）很重要。

该结构表明，ECT2和ECT3识别m6A的口袋结构较为保守，唯一一个可变氨基酸残基（在YTHDF1中的Cys412，在ECT2中的ALA465，在ECT3中的Ser28）通过骨架而不是侧链原子结合m6A修饰的碱基。尤其是ECT2和ECT3没有氨基酸侧链与m6A修饰的腺苷发生立体碰撞，这表明保守的结合口袋区域可用于结合m6A。

因此氨基酸保守性分析以及蛋白同源模型构建等证据都强烈表明ECT2和ECT3可以直接与m6A修饰的碱基相结合。

在人的YTHDF1/2和YTHDC1中，色氨酸（tryptophans）残基位置对应ECT2的W464和ECT3的W283发生突变后，甲基化阅读蛋白与带m6A修饰碱基的亲和力会减弱。

作者先对ect2/ect3突变体进行了构建了ECT2W464A和ECT3W283A报告基因表达载体，结果出叶时间延缓表型被补救成野生型。另外约70%原代转化体（转基因）对ect2/ect3/ect4的表型进行了补救，与野生型相似。然而对m6A结合位点的氨基酸残基进行点突变后，原代转化体表型并未得到任何表型补救。

如此显著的差异表明，芳香基口袋结构域上产生突变后将会使得ECT2和ECT3失去对应的m6A结合的生物学功能。

为了排除ECT2/3功能丧失产生的一系列琐碎的干扰项和原因（如植物体内蛋白的不稳定性等），作者对野生型个体和突变系进行了分离和鉴定。突变株系转入ECT2-mCherry或FLAG-ECT3报告基因载体后，能够几乎完全将ect2/ect3/ect4突变株补救回野生型的表型。然而ECT2W464A和ECT3W283A报告基因表达载体却不能。

综上所述，甲基化阅读蛋白活性的丧失才是造成无法识别m6A的关键原因，蛋白的错误表达或者不稳定性并不是造成芳香基口袋结构域无法与m6A互补的主要原因。因此完整的m6A修饰碱基位点与ECT蛋白相结合必须通过点突变或核心氨基酸残基突变实验才能证明。

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