案例解析：拟南芥m6A甲基化酶FIP37调控茎尖分生组织发育 | m6A专题

文章信息

论文标题：N6-Methyladenosine RNA Modification Regulates Shoot Stem Cell Fate in Arabidopsis

刊登日期：2016年07月

发表杂志：Developmental Cell

影响因子：9.174

研究机构：新加坡国立大学

前言

N6-methyladenosine（m6A）是真核生物mRNA上最普遍的一种甲基化修饰，每条mRNA大约有3-5个残基存在m6A修饰。已经陆续鉴定了m6A所需的Writers, Erasers, Readers。但对其生物学功能还知之甚少。新加坡国立大学的研究人员最近在Developmental Cell杂志上发表文章指出，拟南芥的m6A修饰负责调控茎尖干细胞的命运。

研究人员发现，IP37是拟南芥m6A甲基转移酶复合物的核心组分，对拟南芥mRNA中m6A的总体修饰至关重要。缺乏FIP37的突变体会出现茎端分生组织（SAM）过度增殖，拟南芥整体m6A修饰大大降低。进一步研究表明，FIP37介导的RNA修饰限制了关键干细胞调控子的表达，由此防止茎尖分生组织过度增殖。因此，FIP37介导的m6A修饰在拟南芥发育过程中起到了不可或缺的作用。这种修饰能够调控茎尖干细胞的命运，帮助拟南芥持续生成各种地上器官。

论文框架与流程

FIP37缺失导致茎端分生组织过度增殖

如上图所示RNA甲基转移酶FIP37在不同的植物体内都高度保守，所以作者为了研究FIP37这个甲基化转移酶的功能，采用DNA插入突变的方式构建2个FIP杂合突变体fip37-1S/+和fip37-4/+。这两种突变体在自花授粉后都不能产生纯合的种子。

fip37-1S/+和fip37-4/+未成熟的种子中有25%在颜色以及发育上出现异常。为了评估FIP37在拟南芥种子胚后（post-embryonic）的功能及作用，作者获得27株携带特殊启动子的转基因FIP37拟南芥，以进行表型补救。这些特殊的转基因拟南芥能够在胚胎发育期间激活FIP37基因的表达。

作者对部分fip37-4株系转入了LEC:FIP37进行表型补救。FIP37编码区域受启动子LEAFY COTYLEDON 1（LEC）调控。LEC启动子在拟南芥胚胎发育过程中特别活跃。所以从上图可以发现fip37-4/+携带有LEC：FIP37启动子的拟南芥种子基本发育正常。

尽管LEC1:FIP37启动子可以对拟南芥种子胚胎发育进行补救，但是对拟南芥的胚后发育阶段影响不大。

与野生型相比，fip37-4 LEC1:FIP37的顶端分生组织（SAM）显著增大。仔细观察后发现fip37-4 LEC1:FIP37不仅SAM变大了，而且5日龄幼苗叶片发育也有所延缓。

15天后野生型幼苗叶片的SAM呈现对称的圆形，而突变体则比5天前更大。与正常发育拟南芥相比，突变体只产生了两片分裂的小叶片。20天后，野生型拟南芥进入花期，而突变体的分生组织则不停扩增，呈现密集的细胞堆积而没有观察到任何有关生殖组织和性器官发育的迹象直到死亡。

在野生型中插入AmiR-FIP37后，拟南芥表型与突变体相似，而在野生型中过表达FIP37则表型差异不明显。因此作者得出结论，FIP37对于拟南芥的SAM在胚后发育阶段至关重要。

FIP37在拟南芥增生组织中高表达

RT-qPCR结果表明，FIP37基因在不同组织之间差异较大。利用FIP37-GUS reporter在拟南芥各个组织内监控FIP37的表达情况后发现，FIP37在各个组织尤其是增生组织如嫩叶、嫩茎、牙尖、花序和种子中表达水平异常高。原位杂交实验表明，FIP37在野生型拟南芥的SAM中表达量较高，但是在突变体中表达量较低。定位实验表明FIP37位于核浆中（nucleoplasm）。

拟南芥中FIP37行使m6A甲基化催化功能

已知FIP37是WTAP同源蛋白，结构上相似。作者针对5日龄野生型和突变型采用m6A抗体斑点杂交实验检测其m6A水平后发现，突变体中m6A整体水平显著低于野生型。同时，LC-MS/MS结果也表明，fip37-4 LEC1:FIP37突变体的m6A水平显著低于野生型和FIP37过表达型。

下一步作者使用m6A-seq鉴定到大量基因在m6A甲基化修饰上存在差异，突变体中绝大部分基因都不存在甲基化修饰Peak。

测序结果表明，大部分野生型的基因在3’ UTR和转录终止位点附近存在Peak，而突变体则没有。后续的m6A-IP-qPCR实验也对测序结果进行了佐证。

作者下一步对5日龄的野生型拟南芥和突变型进行了转录组测序后发现组内三个生物学样本重复性较好。

从Peak分布图中可以看到，野生型中绝大部分Peak都集中在TES和3’ UTR附近，而突变体不仅m6A整体水平显著低于野生型，且Peak大部分集中在CDS区。说明FIP37修饰区域可能位于TES和3’ UTR附近。针对Peak中的序列进行motif分析后发现，超过95%的m6A修饰位点存在RRACH motif富集且在不同的拟南芥组中都相似。

FIP37介导m6A修饰抑制STM和WUS表达

转录组数据以及先前大量研究都表明，在SAM过度增殖的组织中，SAM两个关键的调控蛋白WUS和STM都过表达。接下来作者通过分析m6A-seq的结果后还发现，FIP37的表达量不仅与2个基因的转录水平相关，还与2个基因的甲基化修饰水平相关。在突变体中WUS和STM的m6A甲基化水平较低，而野生型中2个基因的m6A甲基化水平较高。针对SAM基因，作者通过m6A-IP-qPCR的验证发现野生型中甲基化水平较高与测序结果吻合。

另外m6A-seq结果表明WUS在终止密码子区域甲基化修饰水平较高，且野生型几乎不表达。下一步作者通过m6A-IP-qPCR对这个结果进行了证实。

作者在芽尖组织观察到STM蛋白和WUS蛋白在突变体拟南芥的SAM中表达量较高，尤其是WUS只在突变体的SAM中特异性表达。    

利用FIP37抗体进行了RIP-qPCR实验后发现，FIP37能够直接与WUS和STM这2个基因相结合。所以综上所述，FIP37能够直接对WUS和STM进行m6A甲基化修饰。

备注：其实作者最早通过测序结果发现，2个基因表达量其实在一大堆高丰度的基因面前并不算突出，无论是甲基化水平还是转录水平。在这里其实很多老师前期也会在分析测序结果中漏掉很多有用的信息。差异结果少，或者目标基因丰度低并不能真正说明问题。数学算法往往会漏掉或误杀老师真正感兴趣的目标基因。在数据挖掘上，最好还是从纯粹的生物学角度出发。另外，测序结果只能从相关性上说明甲基化酶与靶基因有关，如何从相关性到因果性，必须做对应的RIP-PCR才可以。无论是甲基化酶还是去甲基化酶，目前模式生物都有对应的商品化抗体出售，通过甲基化酶的抗体抓取甲基化酶后，可以富集到与甲基化酶结合的靶基因RNA。

除了WUS和STM，作者还对感兴趣的一些候选基因进行了分析，包括与分生组织及叶片起始发育相关的AS2、CLV3、KNKT1，和激素代谢相关的GA1、GA2OX1、YUC5、PIN4、CKX5。但是无论是qPCR还是FIP37抗体的RIP-PCR，都证实了这些候选基因并不直接受FIP37调控。

作者下一步对FIP37缺失的种子中，WUS和STM的表达量进行了动态监测。结果表明5日龄的fip37-4 LEC1:FIP37与野生型相比只有略微提升，但是15日龄的fip37-4 LEC1:FIP37中WUS（>50倍）和STM（>10倍）表达量显著提升。

原位杂交实验表明，与野生型相比，fip37-4 LEC1:FIP37突变体中WUS过表达导致5日龄和15日龄的SAM组织增大特别明显。而另一种重要的调控蛋白CLV3（被WUS激活）则会反过来抑制WUS的表达量，只在5日龄和15日龄SAM组织的外围表达。

叶原基（primordia）初期STM表达量在野生型中表达量较低，然而在5日龄突变体中STM表达量开始增加，15日龄显著提高。

这些表达模式，与WUS和STM在AmiR-fip37中上调这个结果一起，表明在FIP37敲低的拟南芥株系中SAM过度增殖可能与m6A修饰介导后导致的WUS和STM过表达有关。

接下来，作者为了进一步证实是否FIP37能够迅速瞬时的影响WUS和STM的m6A水平和转录表达水平，作者构建了类固醇激素诱导FIP37表达的拟南芥株系fip37-4 gFIP37-GR。已知地塞米松（Dexamethasone）是一种成本极其低廉的人工合成皮质类固醇激素。假如fip37-4 gFIP37-GR株系不对其使用地塞米松，其表型性状与fip37-4 LEC1:FIP37相似。使用地塞米松后，fip37-4 gFIP37-GR表型得到补救。

针对5日龄的fip37-4 gFIP37-GR的茎尖组织使用地塞米松处理后4小时，作者发现WUS和STM的mRNA转录水平显著降低，m6A水平显著提升。但是地塞米松并没有影响到CLV3和KNAT1在茎尖组织中的的转录水平和m6A水平。

作者得出结论，FIP37主要在SAM组织中靶向了WUS和STM并介导其mRNA的m6A修饰。

已经有报道称FIP37与另一种拟南芥甲基化转移酶MTA能够互作（interaction）。本文中作者推测MTA是否能够行使与FIP37相似的功能，调控SAM发育。作者下一步构建了MTA基因干扰的株系AmiR-MTA后发现，其表型与Amir-fip37相似。包括WUS和STM等mRNA在内，不仅m6A水平显著降低，且转录水平显著提高。这些结果皆表明MTA与FIP37在介导SAM组织中WUS和STM的m6A修饰和转录水平上，功能极其相似。

SAM和WUS调控fip37-4 LEC1:FIP37株系中SAM的过度增殖

为了从遗传学的角度来验证WUS和STM是否在fip37-4 LEC1:FIP37中能够影响SAM组织的过度增殖，作者将wus8突变体和stm10突变体进行了杂交。Wus-8与wus-1表型相似，能够不断重复激活有缺陷的SAM使得发育提前终止。而stm-10在产生几片叶子后不能维持SAM。

基本上wus-8和stm-10能够抑制10日龄的fip37-4 LEC1:FIP37幼苗中SAM的增值，而wus-8对于叶片发育的延缓有着更强的作用。

发芽后一个月，55%的wus-8 fip37-4 LEC1:FIP37和40%的stm-10 fip37-4 LEC1:FIP37 能够扩大增殖SAM和叶片上分生组织。尽管这2个株系在表型上比fip37-4 LEC1:FIP37要弱一些，但也证实wus-8或stm-10只会对部分fip37-4 LEC1:FIP37株系的SAM增殖有抑制作用而不是全部。

由于FIP37可以直接靶向WUS和STM进行m6A修饰，所以作者构建了stm-10 wus-8 fip37-4 LEC1:FIP37突变株系。这个突变株系与stm-10和wus-8的表型很相似，在死亡之前没有产生任何SAM和叶片，表明WUS和STM同时都对fip37-4 LEC1:FIP3株系中的SAM过度增殖起作用。相反，clv3-2 fip37-4 LEC1:FIP37株系的结果表明CLV3并不能直接影响SAM增殖。

FIP37影响STM和WUS mRNA的降解

已知FIP37靶向WUS和STM的m6A修饰主要集中在mRNA的3’ UTR和终止密码子附近，作者继续进一步研究两个基因的m6A修饰和转录水平之间的关系。尽管影响mRNA的稳定性存在多种分子机制，m6A修饰是其中一种十分重要的方式。

在哺乳动物中，m6A修饰能够影响mRNA的降解，作者推测在拟南芥中FIP37介导WUS和STM的m6A修饰也能够影响mRNA的稳定性。

作者使用转录抑制剂放线菌素D（actinomycin D）分别处理5日龄的野生型拟南芥和fip37-4 LEC1:FIP37后，分别于8小时和24小时后检测WUS和STM的RNA相对表达水平。结果表明与野生型相比，突变体中WUS和STM降解速度显著增加，而用于对照的β-微管蛋白（TUB8）和WRK6则差异不大。

结论

已知FIP37与哺乳动物的WTAP属于同源家族蛋白，WTAP具有招募（recruit）METTL3、METTL14、KIAA1429、ZFP217、RBM15、RBM15B、HAKAI (CBLL1)以及ZC3H13等蛋白功能。除了METTL3，现在越来越多的研究已证实诸如ZC3H13、KIAA1429可直接调控m6A的修饰。

本文作者研究了FIP37通过介导拟南芥上WUS和STM的m6A修饰，调控拟南芥后期SAM组织的发育。而FIP37的缺失导致WUS和STM这2个基因m6A整体修饰水平大大降低，影响这2个基因的降解，最终导致mRNA在SAM组织中过度富集，最终影响其发育。

其中FIP37发挥招募（recruit）功能，能够将MTA以及其他writers聚集到一起，形成complex蛋白复合物，行使m6A催化修饰功能。MTA是METTL3的同源蛋白，MTB是METTL14的同源蛋白，而Virilizer则是KIAA1249同源蛋白。后期随着CO-IP等技术的发展，相信在植物中也会有越来越多的writers被鉴定出来。

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