干货：mRNA剪切机制简介 | mRNA专题

细胞核内前体mRNA的剪接的执行者是剪接小体，它能够在成熟mRNA出核和翻译之前识别剪接信号，移除不编码内含子，并将能够编码蛋白的外显子拼接在一起。

细胞核内前体mRNA的剪接需要经历2次转酯化反应化步骤去掉内含子才能将相邻的外显子拼接成成熟的mRNA。在前体mRNA上有三个反应区域分别在5'剪接位点(5'SS)，3'剪接位点(3'SS)以及分枝位点（图1）。

除了这三个反应区域外，在多细胞生物体的内含子上还拥有保守性的多聚嘧啶束，它位于3'剪接位点以及分枝位点之间。

图1选择性剪接发生过程示意图。选择性剪接由内含子5'剪接位G和U2个核昔酸点以及3'剪接位点A和G2个核昔酸介导。分支点A核昔酸非常保守的，一般位于3'剪接位点上游20-50个核营酸。剪接反应的过程发生2次转酶化反应，这个过程中需要5个snRNPs复合物(Ul，U2,U4,U5,andU6)。这些复合物能够聚集在前体mRNA上形成大分子的聚合物

剪接小体，核内最大的RNP复合物，能够识别这些反应位点并催化前体mRNA发生剪接。剪接小体中主要的模块是snRNPs复合物。剪接小体一般包含5种snRNPs：U1、U2、U4，U5和U6 snRNP。每一个snRNP包含了单个snRNA和至少7种蛋白亚基。

这些snRNP和另外的非snRNP相关蛋白（例如SF1、U2AF和Prp19复合物）一步步有序的聚集在前体mRNA上依次形成前剪接小体E，A，B以及C复合物（图1）。

在这有序的过程中，这些snRNP以及非snRNP相关蛋白和反应位点之间发生复杂的结合与去结合过程，这些复杂的过程为核小体提供了多次检查的机会以保证它们结合的准确性从而提高位点选择的精确性。

在核小体组装之前，U1 snRNP占据5'剪接位点，而SF1结合在分枝位点，这2个过程是ATP依赖的并最终形成前剪接小体E复合物（图1）。在ATP的参与下.snRNP有序的从前体剪接小体E复合物向剪接小体A、B、C复合物一步步过渡。

第一步的反应是U2 snRNP换下SFl结合在分技位点从而形成A复合物。

之后，预先组装好的U机J6.U5三联体复合物和NTC复合物被招募到剪接位点形成B复合物。

随后，U1和U4 snRNP从复合物中释放出来，而U6 snRNP与U2 snRNP一起结合在5'剪接位点。

这个替代反应促进第一个转脂反应的完成，即5'剪接位点被剪接从而内含子的第一个核营酸和分校位点的A核苦酸之间形成共价键从而导致C复合物的形成。在C复合物中，第二个转酶反应的催化完成，即形成内含子套索结构并将5'和3'的外显子连接最终形成成熟的mRNA（图1）。

1.1 mRNA选择性剪切

在剪接的过程中组成型的外显子被识别并连接在一起组成了编码序列。就某一个基因而言，组成型的外显子总是包含在成熟的mRNA中。

而在选择性剪接中，一个基因能够产生许多不同类型的mRNA，这些不同类型的mRNA被称为亚型。大多数的基因包括组成型的外显子和选择性剪接外显子。

选择性剪接的一个首要的目的是极大的丰富蛋白的多样性，但更重要的是选择性剪接可在时间和空间上调节基因的表达。

剪接的决定受到在不同组织和不同发育时期特异性的顺式转录因子和反式作用元件的协同作用。哺乳动物大部分的基因中估计都有2-20个不同的亚型。在脊推动物中，多外显子的基因平均产生6.3个亚型。在人的细胞中估计大部分的基因(-95%)都存在着选择性剪接。亚型的表达模式在不同组织中有明显不同。

图2 可变接剪接的类型。外显子用盒子表示而内含子用实线显示.选择性剪接的外显子用蓝色和粉红色颜色标出而组成型的外显子用灰色表示。启动子用箭头表示而多聚尾用AAAA表示

选择性剪接的类型大致分为6种，即盒式剪接、互斥外显子剪接、5'选择性剪接、3'选择性剪接、内含子保留剪接、可变起始外显子剪接和可变末端外显子剪接（图2）。

盒式剪接是被普遍阐述的一种选择性剪接形式，它是由于可变外显子的跳跃造成的。

互斥外显子剪接是指前体mRNA保留相互毗连的两个外显子其中的一个，即不能同时包括两个毗连的外显子的一种剪接方式。

5'外显子剪接是指组成型的5'剪接位点上游外显子的出现另一个5'剪接位点时，它能与组成型的5'剪接位点外显子相互竞争，产生外显子3'端截断的外显子拼接。

3'外显子剪接是指组成型的3'剪接位点下游外显子的出现另一个3'剪接位点时，它能与组成型的3'剪接位点外显子相互竞争，产生外显子5'端截断的外显子拼接形式。

内含子保留剪接是指将两个外显子之间的内含子保留的剪接方式。

可变起始外显子剪接是指在改变了转录起始位点的情况下导致的第一个外显子的选择性剪接变化。

可变末端外显子剪接在多聚尾的可变选择下出现的最后一个外显子变化的剪接形式，这种形式的选择性剪接在单细胞高等生物及植物含有短内含子中比较普遍的一种剪接机制。

1.2 剪接位点共同基序序列

我们知道大量的转录特征能够影响剪接位点的选择效率。这些包括核心剪接因子对共同剪接位点的选择与识别，辅助序列以及转录本二级结构特征。

剪接位点选择定义的共同基序包含在内含子末端几乎不会变动的GU和AU双核苷，一般是腺嘌呤(A)的分枝位点。

在5'端的剪接共同基序、（哺乳动物中，[A/C]AG/GURAGU）能够被U1 snRNA的5'端配对识别。剪接分支点(YURAC)能够被E-复合物中的SF1/BBP识别，随后被A-复合物中的U2 snRNA配对识别。3'端的剪接位点(CAG/G)和多聚嘧啶束分别被E-复合物中U2 snRNP的35KD和65KD的蛋白亚基识别。

在出芽酵母S.cerevisiae中，这些共同基序非常的保守，而在哺乳动物中这些共同基序是高度变化的。

剪接位点元件与共同基序的一致性越高，它们与同类结合蛋白如U1 snRNP、U2snRNP、U2AF65或U2AF35结合就越强。如果两个或两个以上的剪接位点存在相互竞争，与共同基序越相近的最有可能胜出。

但是，也有研究报道SRSFl剪接因子的高表达促进U1 snRNP结合在5'剪接位点更强。

在整体水平上，选择性剪接的外显子两边内含子上的共同基序的保守性比组成型的外显子要低。

但是有的剪接位点即使与共同基序的匹配程度不高，但是由于辅助元件的帮助它也能经常的发生剪接。

1.3 剪接辅助元件

多年以来一个明显的共识是，相比出芽酵母，哺乳动物剪接位点共同基序含有的信息不足以精确的定义剪接位点，因为在大量的非功能内含子中含有与剪接位点共同基序非常相似的序列。

辅助元件能够在很大程度上进一步完善哺乳动物剪接位点定义的缺陷。这些辅助元件包括外显子/内含子剪接增强子或沉默子。

许多的辅助元件也是剪接调节蛋白的结合位点，然而也有一些辅助元件只能够被RNA结合蛋白结合，这些蛋白的功能以及哪些辅助元件具有这样的特性还不清楚。

许多辅助元件存在另外一个非常有趣的性质，它们落在不同的位置可能具有完全相反的作用。比如有些元件，它能够被很多的RNA结合蛋白结合。但是也有许多的复合物形成的序列中，它们具有与剪接位点或外显子很高的相似性，这会对剪接因子对位点识别造成一定程度的干扰从而影响正常的剪接反应。

1.4 RNA 二级结构与选择性剪接

像其他RNA介导过程一样，RNA的二级结构也能影响RNA的选择性剪接。

事实上，有4%保守选择性剪接事件与RNA保守的二级结构相关[116]。比较明显的是，单链RNA上的基序序列信息能够被RNA的二级结构所掩盖。这种掩盖作用既能促进也能抑制RNA的选择性剪接。

在另一个方面，RNA的二级结构能够起到将相距较远的RNA元件相互拉近的作用。例如在FGGR2的前体RNA中，RNA的二级结构能将两个分开相距甚远的元件并列在一起，起到激活III b外显子的作用。

尽管RNA的二级结构能够明显的影响一些RNA的剪接事件，但是RNA结合蛋白(如hnRNPs)引起RNA的包装能够与RNA的折叠相互竞争共同调节RNA的二级结构。这些RNA结合蛋白能够集合在新合成的正在转录的前体mRNA上并对RNA进行包装，通过这种方式能够在一定程度上限制了长距离的RNA折叠效应。

1.5 RNA 修饰与选择性剪接

RNA转录后的编辑和修饰对RNA剪接的影响还是一个未被深入探索的领域。

ADARs蛋白可通过A和I的转换这种RNA编辑最普遍的形式来影响选择性剪接。

次黄嘌呤与鸟嘌呤在碱基配对方面的特性非常相似(次黄嘌呤能形成I-C和I-U配对，这跟鸟嘌呤G-C和G-U配对非常类似)，并且在内含子末端的G很容易被I替代。

剪接位点的序列也有可能产生RNA编辑，例如在3'SS能产生AA和AI的转换。A-I转换的编辑形式能够影响辅助元件的活性，但是这也只是在报告载体上进行了A和G转换的实验测试，并且还有可能是ESE结合蛋白不能像识别G一样的去识别I。

另外，RNA编辑可能导致RNA的二级结构弱化从而提高了调控元件之间的接近程度。

在另一方面，非编码RNA的修饰在总体上则更难监测。尽管如此，RNA的m6A修饰是最近广泛研究一种修饰形式。敲低m6A甲基转移酶METTL3后能够导致选择性剪接变化，并且具有选择性剪接特性的外显子和内含子相比组成型的外显子和内含子而言，具有更多的m6A修饰。

然而，甲基化能够影响剪接的最明显的方式是通过影响剪接因子与它们结合位点的结合(这与CTCF蛋白与DNA的结合能够被5mC甲基化所抑制类似)。因而，不同碱基的修饰可能对选择性剪接位点的选择有影响。

但是这些修饰是通过它们自身所具有的转录特性来调节剪接的，如A和I的转换修饰是通过分子内的特异性碱基配对来实现的，而m6A修饰是通过它偏好的共同基序GGACU序列来实现的。

1.6 具有RS 结构蛋白的剪接因子与选择性剪接

大量的起主要和调节作用的剪接因子都具有精氨酸/丝氨酸（RS）富集结构域，除此之外它们还含有RNA识别结构域(RRM)。

含有RS结构域的主要剪接因子包括U2AF亚基以及U1 snRNP复合物中U170K蛋白。在含有RS结构域中最常见的是SR家族蛋白，它的N端含有RRM结构域以及在C端含有RS结构域。

在SR家族蛋白中有一些成员也含有两个RRM结构域。SR家族蛋白能够调节选择性剪接，并且这种调节依赖蛋白浓度。在人的细胞中，SR家族蛋白含有9个成员，除此之外一些SR相关或SR相似蛋白也被发现。

SR蛋白影响了剪接过程中的多个步骤，包括招募U1 snRNP到5'剪接位点，招募U2AF到3'剪接位点以及招募U4/U5/U6复合物到组装剪接体。尽管SR蛋白起初在组成型剪接过程中被认为是冗余的，但是随后的研究发现它们有转录特异的非冗余的功能，尤其是在ESE依赖的剪接中。

SR蛋白家族的RRM结构域有不同的RNA结合倾向性。对SR蛋白来说，它们结合的序列选择可以作为ESE。

对单个SR蛋白来说，它的功能的选择揭示了不同的SR蛋白能结合不同的ESE。在整体水平上对不同SR结合蛋白结合序列分析发现，它们之间结合的序列的低重叠率进一步说明了SR蛋白在功能上不是冗余的。

与转录因子的激活结构域一样，SR蛋白的RS结构域也被认为是ESE依赖剪接的"效应"结构域。RS结构域能够在很大程度上被SRPK和CLK家族蛋白激酶磷酸化修饰。

在剪接小体循环的过程中，磷酸化和去磷酸化是非常必要的，并且磷酸化的水平能够调节蛋白核质穿梭以及蛋白之间的相互作用。

但是，SRSF1可以不通过结合剪接位点的方式来调节剪接，并且这个过程并不需要RS结构域起作用。

尽管RS结构域最常见功能是促进剪接发生，但是它也能在剪接发生过程中起到抑制作用，尤其当它们结合在内含子上时。

事实上，SR相关蛋白SRrp38在有丝分裂或热激条件下的低磷酸化水平能抑制剪接。相反，当它的RS结构域被磷酸化时，它能高强度的结合在ESE区域并能促进剪接。

1.7 其他RNA 结合蛋白与选择性剪接

很多的其他RNA结合蛋白也能参与剪接调控过程。这些蛋白包括含RRM或KHRNA结合结构域的hnRNP家族蛋白，以及其他含有RNA结合结构域(如铮指结构，Y-box结构域等)的蛋白。

hnRNP蛋白能够在很多不同细胞类型中有表达。有一些hnRNP蛋白在不同类型的细胞中高表达，而它的同源蛋白在某些细胞中可能表达量非常有限。

例如，Nptb和hnRNPL只在分化的神经元细胞和激活的T细胞中高表达，而它们的同源蛋白PTB和hnRNPL却在很多类型的细胞中都高表达。

其他的非hnRNP蛋白，比如FOX、CELF、Nsr100及NOVA蛋白表达有很强的组织特异性。尽管一些hnRNP蛋白起初被鉴定对剪接有抑制作用，但是现在越来越清楚的是大部分的蛋白既能作为抑制因子也能作为促进因子调控剪接，这取决于它们结合刚RNA位点在哪里。

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