肠道菌群与疾病因果性的研究策略 | 微生物专题

Original 市场部-PW 联川生物 2022-05-21

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今天来说说研究肠道菌群与疾病因果关系的通用性策略。

这个策略来自于国内肠道菌群研究大牛赵立平教授2013年在Nature Reviews Microbiology上发表的综述“肠道菌群与肥胖：从相关到因果”。在这篇文章中，赵教授也提出了全微生物组关联分析（Microbiome-wide association studies, MiWASs）方法。文章的精彩观点在菌群老赵公众号上已做解读，此处不再赘述。我们重点来看其中论证因果关系的研究策略（图1）。

图1 证明肠道菌群在慢性病中致病作用的策略

为筛选可能与某特定慢性疾病的病因学或发展相关的所有潜在的关键肠道菌群种系，在遵循“科赫法则”的逻辑框架下，建议进行全微生物组关联分析（MiWASs）,开展

1）横断面研究或纵向研究，

2）并进行时序性和多类型采样，

3）以获得宿主表型和肠道菌群的组成和功能谱的测定，

4）再使用多元统计工具，如主成分分析，冗余分析和偏最小二乘模型，鉴定出肠道菌群中候选关键成员作为假定的病原；

接着，

5）进行序列引导的分离，以获得关键细菌的纯培养，然后用关键细菌和/或确定的相关细菌组合在灵长类动物中重现该疾病，以生成该疾病的动物模型；重点从表型、代谢组、转录组、蛋白质组考察宿主和微生物的相互作用；

6）对于那些难以获得候选关键细菌纯培养的疾病，可以进行大规模的干预研究，以评估候选菌丰度的降低是否会导致疾病表型的改善；使用多组学协变分析找出候选关键菌和粪便、尿、血清和/或血浆代谢物，甚至整个转录组或蛋白质组途径的相关变化模式；任何这种相关性都可能表明假定病因与疾病之间存在关联。

MiWASs

一种与全基因组关联分析（GWASs）类似的非靶向且自上而下的研究方法，被定义为在没有任何先前假设的情况下探索整个人类微生物组的结构变化，目的是识别与所关注的疾病或表型相关的微生物物种、基因或代谢物。

这样就够了吗，还有一个重要的菌群知识点，你也需要知道。肠道菌群是一个复杂的微生物生态系统，由数百种细菌组成，每种细菌都含有许多遗传多样性很高的菌株。在细菌分类学中，一个“种”内可以含有不同的菌株，它们的基因组同源性最多可以相差30%。属于同一个种的两个不同菌株之间的遗传差异甚至会超过人和小鼠之间的遗传差异——后者间的遗传差异仅有10%。正因为这样，来自同一个属乃至门的不同种/株，它们与同一个表型之间可以有非常多样的关系——其中的一部分可以是正相关关系，一部分可以是负相关，余下的可以根本没有相关性，而非按常理，同一个属甚或种应该都具有相同的作用。也就是说，研究菌群与疾病的关系时，按分类学进行降维分析，是不符合遗传学规律的，按菌群的功能协同性来降维分析，应该是更为科学的。在研究中，尽量鉴定到菌株水平才有可能发现和鉴定出影响人体疾病发生、发展的关键功能细菌种群。

我们以人体代谢疾病为例，来看看从菌株水平讨论肠道菌群在疾病中作用的策略（图2）。该策略是前述通用性策略的实践版。

图2 整合宏基因组学和代谢组学方法剖析肠道菌群在菌株水平对人体代谢性疾病的作用

这套研究策略可概括为：

1）纵向、干预试验配以时序性和多类型采样，测定肠道菌群在菌株水平的变化、宿主疾病表型以及代谢表型的差异。从血液样品中，获得生理、生化参数作为疾病表型变化的数据。

2）从粪便样品中，提取所有的DNA并进行宏基因组测序。在每个独立的样品中进行组装和基因预测，将所有样品中得到的基因进行整合，构建非冗余肠道微生物基因集合。

3）通过比对上非冗余基因的短序列数计算每个基因在每个样品中的丰度，然后通过Canopy算法将基因集合中的基因根据它们的丰度聚类成为CAG。

4）将每个样品中能够比对上CAG基因及相应contig的短序列进行组装，得到能够代表一个菌株或是一群高度相似菌株的高质量基因组草图。

5）对于尿液、血液和粪悬液样品，采用如LC-MS等方法得到代谢物全谱信息，用于测定代谢物/宿主菌群共代谢物的变化。

6）在干预过程中发生变化的代谢物可以采用多元统计方法进行识别，这些代谢物可能与疾病表型相关联。

7）将这些重要的代谢物与细菌基因组进行关联，识别携带有能够产生这些疾病相关代谢物或其前体基因的菌株。

8）根据基因组特性，尝试将这些菌株进行分离培养。如能得到分离株，则将单个分离株或者分离株组合接种无菌小鼠构建悉生小鼠模型，用于验证和观察它们在代谢性疾病发生、发展中的作用。

9）通过上述步骤，尝试回答与肠道菌群与疾病关系研究的三个根本问题：“谁在那里？”“它们能做什么？”以及“它们怎么做？”。