单细胞RNA-seq分析揭示人类骨关节炎进展

背景

类风湿关节炎（Rheumatoid arthritis，RA）和骨关节炎（Osteoarthritis，OA）是常见的风湿性疾病，主要累及关节。RA是较常见的自身免疫性疾病之一，影响全球约1％的人口。RA的确切原因尚不清楚，然而疾病的发作似乎是由于遗传易感性，环境触发因素和机会之间的相互作用所致。RA的特征是关节滑膜中的炎症过程失调，最终导致关节的软骨和骨质元素被破坏，从而导致疼痛和残疾。与RA相关的全身性炎症与多种关节外合并症（包括心血管疾病）相关，导致RA患者的死亡率增加。OA是最普遍的肌肉骨骼疾病，也是关节炎的最常见形式，涉及关节软骨，软骨下骨，韧带，膜囊，滑膜和关节周围肌肉的结构改变，疼痛是主要症状。OA的标志是关节软骨变性，下层骨重塑和滑膜炎。OA是全球致残的主要原因，它影响了40％的70岁以上的人群，并伴有合并症和死亡的风险增加。

单细胞测序作为这两年来新兴起的技术，在不同研究方向均得到了广泛应用。在关节炎研究中，目前也发表了一些文章，编者做了相应整理和部分文章解读，以飨读者。

标题	期刊	发表时间	技术手段
Distinct fibroblast   subsets drive inflammation and damage in arthritis	Nature	2019.5	10 X
Defining inflammatory   cell states in rheumatoid arthritis joint synovial tissues by integrating   single-cell transcriptomics and mass cytometry	Nature Immunology	2019.5.6	CEL-seq2
Methods for high-dimensonal   analysis of cells dissociated from cryopreserved synovial tissue	Arthritis Research & Therapy	2018．7.11	CEL-Seq2
Single-cell RNA-seq   analysis reveals the progression of human osteoarthritis	ANNALS OF THE RHEUMATIC DISEASES	2018.7.19	STRT
Single-cell RNA-seq of   rheumatoid arthritis synovial tissue using   low-cost microfluidic instrumentation	Nature communication	2018.2.23	microfluidic
Similar Transition   Processes in Synovial Fibroblasts from Rheumatoid Arthritis and   Osteoarthritis_ A Single-Cell Study	Journal of Immunology Research	2019.7.24	Smart-Seq2
Functionally   distinct disease-associated fibroblast subsets in rheumatoid arthritis	Nature communication	2018.2.23	Smart-Seq2
Mixed-Effects Association   of Single Cells Identifies an Expanded Effector CD4+ T Cell Subset in   Rheumatoid Arthritis	SCIENCE TRANSLATIONAL MEDICINE	2018.10.17	Smart-Seq2
Pathologically expanded   peripheral T helper cell subset drives B cells in rheumatoid arthritis	Nature	2017.7.1	Smart-Seq2

题目：单细胞RNA-seq分析揭示人类骨关节炎进展

单位：中国人民解放军总医院骨科、北京大学北京未来基因诊断高精尖创新中心

发表时间：2018.7.19

期刊：ANNALS OF THE RHEUMATIC DISEASES

IF : 14.299

技术手段：单细胞转录组测序（STRT）、 免疫组化

目的：了解人类软骨变性和再生的分子机制有助于改善治疗骨关节炎（OA）的治疗策略，使用单细胞RNA测序分析了解人类OA发病机理的分子程序和谱系进展模式

文章结果

对10例接受骨关节置换手术、5个疾病阶段（state1-5）软骨样本的1600个软骨细胞进行了单细胞测序，数据过滤后1464个细胞用于下游分析（上图A、B）；

PCA分析发现沿PC2表现出明显的病程进展（上图C、D），PC2层次上100个基因（50个PC2阳性基因和50个PC2阴性基因）聚类得到4个clusters。ClusterA组主要由state3和state4软骨细胞组成（胞外基质组织、胶原蛋白分解代谢），ClusterB组主要由state0和state1软骨细胞组成（骨骼系统的发育和细胞压力应答）（上图E、F）；

TF分析发现DNAJC2, GZF1 和ETS2主要在OA早期表达， SOX4、 TRPS1 和 EGR2要在OA晚期表达（上图G、H）。

单细胞聚类分析得到7个细胞cluster：ProCs,（增殖软骨细胞）、 preHTCs（肥大前软骨细胞）、HTCs（肥大软骨细胞）、FCs（纤维软骨细胞）、ECs（效应软骨细胞）、RegCs（调控软骨细胞）、HomCs（自我平衡软骨细胞）（上图A、D）；

拟时序分析发现EC分布在轨迹的起点，RegC和HomC沿轨迹存在， ProC位于preHTC和HTC的前端，而FC则主要分布在末尾（上图B）；

疾病阶段细胞类型分析发现ECs和RegCs主要是早期OA软骨细胞，而preHTCs，HTCs和FCs主要是晚期OA软骨细胞（上图C）；

组织学检测发现大多数EC和RegCs分布在软骨表层区域，ProCs分布在软骨增生区域，preHTC和HTC分布在软骨肥大区， FCs主要是晚期OA软骨细胞，HomCs分布在每一层软骨中（上图F）。

ECs和RegCs是新定义OA细胞群体，岁OA发展数量减少。ECs表现出较高的代谢速率，包括与三羧酸循环、糖酵解、氧化磷酸化和脂及氨基酸代谢等相关的进程，提示ECs在能量代谢方面比较活跃。

RegCs主要特征是多种信号通路同时处于活跃状态（例如Toll-like receptor,mTOR, TGF-b, p53, JAK/STAT, WNT 和趋化因子信号），提示RegCs在骨关节炎病程中可能发挥重要的作用。GSEA显示RegCs表达抗原处理和抗原呈递相关的基因，并且固有免疫系统的特异标志物在一部分调节性软骨细胞中高水平表达，提示这些细胞具有与免疫细胞激活相关的功能。

ProC、preHTC和HTC是在人类OA关节软骨中实证的三种细胞类型，拟时序分析确定preHTC 是ProC 和 HTC的中间状态（上图A-C），特定代表性基因的拟时序表达动态也标志着从ProC到preHTC到HTC的进展（上图D），而HTC可以进一步聚类为两个亚群（HTC-A、HTC-B），具有不同的表达模式：HTC-A表达与软骨发育，结缔组织发育和负生长调节相关的基因，HTC-B丰富与细胞外基质组织，骨化和矿化有关的基因（上图E、F）。

FCs是一种晚期OA软骨细胞，表达纤维细胞表型标记物（COL1A1，COL3A1，COL5A1，S100A4）（上图A）以及胶原纤维组织，血管系统发育，分解代谢和细胞迁移相关的基因（上图D）。对每个软骨细胞的G1/S和G2/M阶段标志的表达进行评分，发现一小部分软骨细胞正在增殖（上图B）。

CPCs（cartilage progenitor cells，软骨组细胞）特异性表达基因显示出与已知CPCs生物学特性相关的特征，包括细胞周期，染色体组织和DNA复制（上图D）。分析确定CPC的标记基因：BIRC5，CENPU，UNE2C，DHFR和STMN1（上图C），这将有助于研究CPC在人类OA软骨再生中的作用

HomC表达基因主要集中在与调节细胞稳态有关的过程中，包括调节细胞周期，发育，RNA代谢和生物合成，并且在OA的每个阶段，来自该簇的细胞比例相对稳定。同时HomC高表达生物钟节律标志基因（例如PER和SIRT1）（上图E、F）。该细胞亚型的发现提示了生物钟相关机制紊乱可能参与了骨关节炎的发生。

为了研究所有类型OA软骨细胞与可用临床数据之间的关系，研究人员建立了骨关节炎不同类群软骨细胞和临床医学特征之间的联系，定义了“骨关节炎关节软骨样本严重指数”指标，该指标结合了特殊手术医院（HSS）膝关节评分系统和OA分期（上图A）。生物信息学分析发现了和骨关节炎疾病发生相关的336个特征基因，包括199个有利和137个不利基因。有利基因主要在EC，RegC和HomC中表达，不利基因在大部分ProC，preHTC和FC中表达（上图B）。表明ECs，RegCs和HomCs可以在OA发展中保护软骨，而ProCs、PreHTCs、HomCs、FCs可以促进OA发展。

RT-qPCR分析发现有益基因（ADRM1和HSPA2）和不利基因（RPS29和COL5A1）无法将早期OA患者（stage 0）与对照区分开来（对照样本是16个健康人和16个类风湿性关节炎患者）。但是可以在晚期OA中，ADRM1、HSPA2、RPS29和COL5A1可作为有价值的生物标志物，曲线下面积分别为0.878、0.896、0.899、0.936（上图G）

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