题目：单细胞RNA-seq解析成人卵巢中卵泡重构过程单位：荷兰莱顿大学、比利时根特大学发表时间：2019.7.18期刊：Nature Communications技术手段：单细胞转录组测序（10X）、在没有妊娠的情况下，健康女性的整个生殖期（约40年）中，卵巢和子宫每月均会经历重塑。出生时卵巢中存在100万个卵泡，但只有约500个会处于健康女性的排卵期，而其余的则退化。卵泡生长涉及：（1）卵母细胞成熟；（2）颗粒细胞（GC）增殖和分化，形成支持包裹卵母细胞的卵丘细胞和紧靠着卵泡壁的壁颗粒细胞；（3）以高血管化作用从卵泡周围的基质细胞中产生出一层特异的卵泡膜细胞（TC）。卵泡发生的任何阶段都会发生卵泡变性或闭锁，每月只有一个优势卵泡到达排卵期，通过闭锁有效地去除其他生长阶段的卵泡，以适应随后的卵泡生长波，这对于卵巢稳态十分重要。同时每月卵巢也会进行强大的组织重塑，使得排卵性卵泡转化为产生激素的黄体（由粒黄体细胞，膜黄体细胞和血管系统形成），然后退化为白体。由于人类对卵泡生长和变性的连续过程还不甚了解，而了解这些机制对于查明不孕症的原因以及开发治疗方法和疾病模型至关重要，因此研究人员使用人类成年卵巢进行了单细胞RNA测序，构建了生长和退化卵泡的分子信号，确定了不同类型的颗粒细胞和卵泡膜细胞，并检测了（闭锁性）卵泡膜细胞和基质细胞在局部产生补体系统的成分，同时还检测到了适应性免疫细胞和先天性免疫细胞，以及几种协助重塑过程的内皮细胞和平滑肌细胞。研究人员首先分析了接受了生育能力保存(外皮层冷冻保存)的5名匿名成年女性的卵巢组织(内皮层)：包括数个小的窦状卵泡（外径约为2-4mm的组织，包括间质，TC和可见的直径为1-2mm的卵泡）和selectable follicles（外径约为5-8mm的组织，包括间质，TC，以及直径2-5mm的可见卵泡）（图1a、b）。闭锁（早期）阶段的卵泡（图1b）的大小类似于生长卵泡（图1a），但壁颗粒细胞和TC有所不同，与生长中的卵泡相比，闭锁（早期）阶段的卵泡（图1c）显示出较少的细胞增殖，并且凋亡水平中等（图1d）。在这些闭锁卵泡（早期）中，TC层显示出明显的黄体化迹象（肥大形态），而GC从基底膜分离。从这些成年卵巢（N = 5）的内层皮层中总共收集了31份组织样本，包括基质和不同大小的可见卵泡用于单细胞测序。卵巢组织酶解后，每个样品进行FACS分选以去除死细胞（图2），并使用10X Genomics平台通过单细胞测序进行分析。使用R包Seurat过滤数据，并进一步排除了高水平表达（>总UMI的6％）的细胞。56,206个细胞中保留了20676个细胞用于进一步分析。基于Seurat对细胞进行了聚类并确定了19个clusters（图3b），选取每个cluster的前30个差异表达基因，经过过滤后作为每个细胞cluster的代表基因（图3c）。使用每个细胞cluster中前50个差异表达基因进行聚类，区分获得了五种主要的细胞类型：颗粒细胞（GC，五个clusters），TC和基质（五个clusters），平滑肌细胞（两个clusters），内皮细胞（三个clusters）和免疫细胞（四个clusters）（上图d）。为了确认这些细胞类型，研究人员根据几种marker基因对不同细胞做t-SNE细胞图谱映射分析：AMH，HSD17B1，SERPINE2，GSTA1（用于颗粒细胞）；DCN，LUM用于TC和基质，TAGLN和RGS5用于平滑肌细胞；VWF和CLDN5用于内皮细胞；CD53和CXCR4用于免疫细胞（图3e）。近年来，卵巢的血管重塑支持滤泡生长和变性的动态变化引起了越来越多的关注。研究人员通过单细胞测序确定了三个独立内皮细胞clusters（CL7，CL9，CL16），它们表达与淋巴和血管系统相关的基因（例如PECAM1，CD34，CTGF），同时也表达与重塑和炎症反应相关的基因（例如TXNIP，ANGPT2）（图4a–d）。CL7的DEGs（例如CCL14，SOCS3，EGFL7）和CL16的DEGs（例如CCL21，TFF3）分别与血管生成和淋巴管相关，而CL9（TM4SF1，NMMT）的DEGs与细胞凋亡的调节更为相关（图4c，d）。平滑肌细胞clusters（CL14，CL17）显示出生长和重塑的特征：CL17的许多DEGs（例如CRYAB，GJA4）参与免疫应答和细胞凋亡的调节，而CL14的DEGs（例如ACTAA2，PLN，ADIRF和MYH11）与成熟的平滑肌细胞相关（图4e-g）。为了揭示囊状卵泡成熟过程中细胞的动态变化，研究人员首先对囊状卵泡中的颗粒细胞进行了分析（上图a）。小窦卵泡（直径1-2mm）的GC明显聚集在CL15中，显示出WT1high / EGR4high / VCANlow / FSTlow表达（图5b），表明在此阶段，壁颗粒细胞和卵丘细胞仍具有共同的祖细胞（pGC））基因表达特征。WT1在GC中表达，特别是在形成放射冠的GC中表达（图5c）。selectable follicles（直径2–5mm）的GC分为两种主要细胞类型：卵丘细胞GC（VCANhigh / FSThigh / IGFBP2high / HTRA1high / INHBBhigh / IHHhigh）和壁颗粒细胞（WT1low / EGR4low / KRT18high / CITED2high / LIHPhigh / AKIRIN1high）（图5b）。CL10中包含的GC来自于几个特定样本（例如selectable follicles D）（图5a）。CL10的GC中几种GC标记物（例如VCAN和FST）和KRT18呈阴性（图5b），类似于闭锁卵泡中泛KRT阴性GC（图5d），这表明CL10可能代表闭锁早期的GC。与其他GC cluster相比，CL10中的GC GJA1和CDH2表达较低（图6a，b）。与健康的卵泡相比，大鼠闭锁GC中GJA1的表达水平较低，这表明间隙连接减少，细胞通讯在闭锁中起作用。免疫染色证实了与生长中的卵泡（图6c，d，顶部两行）相比，人的闭锁卵泡的GC中GJA1和CDH2的表达较低（图6c，d，底部两行）。使用Monocle 3 进行拟时序分析，发现pGC（CL15）可以分支为壁颗粒细胞（CL11）和成熟的卵丘细胞（CL8和CL3）（图7a）。由于拟时序分析很容易受到个体差异的影响，单独对两个个体（P7和P3）的细胞做拟时序分析，获得的细胞轨迹与通过扩散图获得的细胞轨迹一致（图7b）。早期与GC不相关的几个基因包括TNNI3，MAGED2，SPINT2 PLA2G16，BEX1，DSP，TSPAN6和LCMT1（图7c）。免疫荧光验证了TNNI3在GC中的表达，并观察到了特定的细胞定位（图7d）TC包含三个clulsters（CL2，CL5，CL6），来自（健康）卵泡（卵泡样本A，B和C）的TC主要聚集在CL5中，其特征在于表达PTH1，APOD，APOC1和一些与TC无关的基因，例如WFDC1，MATN2，COLEC11（图8a）。在CL5中，来自小窦卵泡A和B的TC与来自可选择卵泡C的TC不重叠，为了探究CL5内部之间的差异，将CL5细胞进一步聚类得到TC亚群（T0-T4）（图8b）。将获得的TC亚群的差异基因（图8c）与两种独立的拟时序分析方法（Monocle 3 alpha和Diffusion）（图8d，e）相结合，发现来自小卵泡的TC与普通祖细胞TC（pTC）相对应，后者从可选卵泡发展为内部TC（inTC）和外部TC（exTC）。CL-T0和CL-T1均表达pTC基因，但CL-T0中的细胞还额外表达应激相关基因（例如FOS，JUN）（图8c）。CL-T2和CL-T4基因表达类似exTC，但CL-T2中的细胞也表达与应激相关的基因（FOS，JUN）（图8c）。两种拟时序分析中CL-T2（应激exTC）获得的轨迹存在差异：Monocle分析获得了pTC→应激pTC + pTC→inTC→exTC→应激exTC（图7d）；相比之下，diffusion maps分析中，两个应激TC群体（CL-T0和CL-T2）处于同一轨迹，观察到pTC→应激pTC→应激exTC + pTC→inTC→exTC（图8d）。对STAR和ACTA2的免疫染色可以区分生长卵泡中的inTC和exTC，在闭锁卵泡中，STAR在TC中表达，而ACTA2主要局限于平滑肌细胞中（图8f。）来自卵泡D（早期闭锁）以及基质样本的TC主要存在于CL2和CL6中，表明它们可能代表了闭锁卵泡TC。与CL5中的TC相比，CL2和CL6中的TC表达IFITM3，同时COL3A1的表达水平较低，而FOS和IGFBP5的表达水平较高（图9a）。免疫染色确认FOS和IGFBP5在早期闭锁卵泡的TC中表达，并与DNA/RNA损伤标记8OHdG和STAR共定位（图9b，c，底部），这与生长卵泡中的TC相反（图9b，c，顶行）。大部分来自selectable follicle C的基质细胞聚集在CL1中，尽管基质cluster（CL0，CL1）显示出高表达的GNL3和ARID5B（图9d），但CL0还表达了高水平的XBP1和SELK（图9e），两者均参与内质网应激诱导的细胞凋亡，而CL1表达高水平的GPRC5A和TNFRS12A（图9f）。TC clusters（CL2、CL5、CL6）和基质（CL1）都表现出几个补体系统基因的高表达，例如C1R，C1S和C7（图10a）。CL1，CL2，CL5和CL6中的基因互作网络揭示了补体基因与TC和基质基因（例如LUM，COL6A1，COL1A1）之间的关联（图10b）。另一方面，卵巢中的pGC，壁颗粒细胞和其他细胞群表达CD55和CD59，它们可以防止补体级联的靶向作用和损伤（图10a），这表明存在一种涉及补体系统的协同机制，可使不同卵泡及时生长和退化。据报道，补体系统存在于接受体外受精（IVF）治疗的妇女的卵泡液中，但与人类成年卵巢的生理组织重塑无关。使用免疫荧光证实从健康卵泡到退化卵泡过程中，C1S表达增加（图10c，d），C1Q主要由卵巢中存在的巨噬细胞（CD68+）中表达，而退化的卵泡中巨噬细胞（CD68 +）增多（图10c，d），表明卵泡重塑过程中存在先天免疫反应。虽然大多数循环补体蛋白(除了C1Q和C7)是在肝脏中产生的，但在各种组织和细胞中已经检测到补体的局部产生，为了确定卵巢细胞局部产生补体成分，将人卵巢基质（N = 3）和闭孔卵泡壁（N = 6）培养了1天和5天，并通过ELISA确定了C1Q和C3的浓度，观察到第5天C1Q和C3水平较低，但水平不断上升（图10e），表明卵巢可能有助于循环补体蛋白的局部产生。最后，分析发现卵巢中存在明显的CD53high /CXCR4high免疫细胞，包括适应性T淋巴细胞和天然杀伤（NK）细胞（CL4和CL12），B淋巴细胞（CL18）和先天免疫系统，例如单核细胞和巨噬细胞（CL13）。一些先天免疫细胞表达高水平的CD68和IFI30，以及补体成分C1QA（图10f，g）。B淋巴细胞表达高水平的JCHAIN和IGKC（图10h），T淋巴细胞（和NK细胞）表达IL7R，LTB，CCL5和NKG7（图10i）