Clin Cancer Res:单细胞分析揭示与皮肤T细胞淋巴瘤进展相关的潜在异质性 | 10X单细胞测序

论文标题：Single-cell profiling of cutaneous T-cell lymphoma reveals underlying heterogeneity associated with disease progression

刊登日期：2019年2月

发表杂志：clinical cancer research

影响因子：9.619

研究机构：爱荷华大学

技术手段：单细胞转录组测序、单细胞TCR

前言

皮肤T细胞淋巴瘤（Cutaneous T cell lymphomas，CTCL）是一组以皮肤损害为初发或突出表现的T细胞淋巴瘤，包括原发性或继发性淋巴瘤。两种主要的原发性皮肤T细胞淋巴瘤包括蕈样肉芽肿（mycosis fungoides，MF）及Sézary综合征（Sézary syndrome，SS），两者病因均被认为有成熟的皮肤归巢CD4⁺ T细胞诱发。鉴于这种共性以及二者经常重叠的临床病理学特征，MF和SS历来被视为密切相关。但是最近一些研究表明，SS和MF具有不同细胞起源，二者临床上存在差异：SS是一种罕见的CTCL，其特征是恶性细胞循环和皮肤广泛受累，5年生存率低；MF是常见的CTCL，通常表现惰性病程，5年生存率为70-80％。针对晚期MF和SS的治疗一般无效，导致了该患者群体的发病率和死亡率。建立识别那些将会进展为晚期和广泛疾病的患者的方法，可以促进从皮肤定向疗法到更积极治疗转变，但是这种方法尚未建立。

尽管对CTCL进行了大量高质量的基因水平研究，但分化T细胞表型的发展及其与疾病发病机理的关系依然不是很清楚。特别是Treg样细胞对MF/SS中恶性群体的贡献一直存在争议，其结果不同且有时相互矛盾。一项针对单个细胞的基因测序表明SS内部存在异质性，因此更深入地了解CTCL中恶性群体的差异，可能对更有效的治疗方案提供更好的见解。

作者对分离的SS细胞与匹配的正常CD4⁺ T细胞进行了单细胞RNA测序和单细胞V-D-J测序。作者分析了恶性细胞群内异源转录谱的程度和轨迹，确定了可能有助于CTCL检测、诊断和分期的SS新标记。通过将研究结果应用于由大量CTCL患者组成的公共数据集，进一步验证了该方法的准确性，并证明当与基于人工智能的方法结合使用时，转录组表达谱可以区分早期和晚期疾病。

文章结果

1. 表达谱数据区分恶性和正常CD4⁺T细胞

作者招募了一位61岁男性SS患者和健康志愿者，分别分选了恶性CD4细胞(CD3⁺CD4⁺CD5^brightSSC^hi，SS细胞)和非恶性CD4细胞(CD3⁺CD4⁺CD5^intSSC^int，正常细胞)（下图B），对两类细胞进行了单细胞5’转录组测序和TCR测序（下图A），患者和健康志愿者分别捕获到3526和4485个细胞，细胞过滤后（保留表达基因数量200-3500，线粒体基因比例低于9%的细胞），对其中3443和4436个细胞进行了聚类，基于基因表达结果共获得了12个聚类（下图C），并选择5-7个基因定义细胞群体（下图D），tSNE细胞聚类和Euclidean hierarchical clustering分析发现正常细胞主要包含6个细胞类群（cluster 0、2、3、6、7、8、10），非正常细胞（SS细胞）包含5个细胞类群（cluster1、4、5、9、11）（下图E）。通过与已知marker基因做相关性分析，发现大部分正常和SS细胞起源与CD4⁺T_cm细胞（CD4⁺ central memory T cells）相关（下图F）。

2. SS细胞单克隆并且与正常CD4⁺ T细胞有不一样的转录特征

作者使用已经报道的marker基因（CD4、CD8A、CD5、CD7、DPP4、CD70）进一步确定了正常细胞和SS细胞的差异，发现SS细胞中CD26（DPP4）表达下调，CD70表达上调（下图A）。作者做了单细胞V-D-J测序，覆盖到了94.7%的细胞。 3328个检测到TCR信息的SS细胞中，绝大部分细胞（97.3%）只有一种克隆型：TRBV14和TRAV9-2。与之对应，正常细胞有4007个克隆型，但只有37个细胞（0.9%）拥有TRBV14和TRAV9-2克隆型（下图B）。

为了研究SS潜在的新标志物和/或治疗靶点，作者分析了SS细胞和正常细胞的基因表达差异。其中TRBV14和TRAV9-2在两种来源细胞中差异最大，并且95.5% SS细胞表达TRBV21-1（下图C）。作者采用这种方法，检验了bulk RNA-seq鉴定到的SS相关基因，包括CCR4、DUSP1、GPR15、ICAM2、JUNB、PLS3、ITGB1、GATA3、NEDD4L、LAT、MGAT4A、PDCD1、SKAP1、aTOX，发现它们在SS细胞和正常细胞中表达存在差异（下图D）。以阈值|log2FC>1| & Δpercentage >50%筛选到的基因中，包含了一些新的marker基因，例如SAMSN1（参与干扰素α抗性）、TSPAN2（一种细胞表面蛋白，参与了肺癌细胞迁移），它们的表达表现出了细胞差异（下图E）。

3. SS细胞转录异质性

不像以前的bulk测序，单细胞转录组测序能够在单细胞水平区分SS细胞的表达异质性，依据基因表达，SS细胞可分为5个细胞群体（cluster1、4、5、9、11）（下图A）。作者使用Monocle 2 对SS细胞做了拟时序分析，尽管TCR反映了SS细胞单克隆扩增，但拟时序分析发现了明显的细胞轨迹分叉结构，暗示SS细胞在转录水平存在分歧，依据分析结果，SS细胞从cluster9进行到cluster1、cluster4和cluster5(state1，虚线)或cluster11（state2，实线）（下图B）。作者分析了SS细胞中主要免疫因子(FOXP3, GATA3, IKZF2）的表达，发现FOXP3在两个状态下表达下降，但GATA3, IKZF2在state 2中表达上调（下图C）。作者对skin-homing T cells、central memory T cells和 Tregs marker基因在SS细胞中的表达进行了分析，发现不同基因具有不同的表达模式（下图D）。

作者接下来进行了分支表达分析建模，以识别不同SS转录状态下显著差异表达的基因。ward.D2聚类算法将所有基因共分为4组（C.1-C.4），state2（C.2-C.4）中上调基因主要由免疫介质组成，C.1组基因在state 1表达，主要是核糖体基因（下图E）。通过单细胞GSEA分析（ssGSEA），发现T细胞相关基因集在不同SS细胞群体间显著差异（下图F）：Cluster 11（state 2终末端）显著富集II型干扰素信号、终末分化和细胞溶解活性基因，cluster1、2、5缺乏明显的基因改变，只在cluster5中富集缺氧基因set。Cluster 9富集抗炎和Treg markers（下图F、G）。

4. 人工智能（AI）用于预测疾病发展阶段

由于MF和SS有非常相似的遗传特征，而且晚期MF与SS有重叠的临床特征，治疗方法往往相似，所以为了更好地确定和验证观察到的异质性是否具有临床意义，作者从CTCL患者队列（152例MF患者，包含早期、中期和晚期三个阶段，针对344个基因做了靶向测序）中选择了63例早期和34例晚期CTCL患者，并从单细胞数据选择93个基因用于疾病预测。作者将队列分为训练集（n=48）和验证集（n=49）（下图A），并将验证集一系列增强分类树（n=10000）（下图B），利用分类树验证集（n=49）样本正确的分为早期和晚期样本（79.4%）（下图C），通过对每个基因的变量重要性进行排序，发现FOXP3对分类的相对影响力最大（10.39%），其次是TGFB1 (5.37%)、CD7 (5.09%)、PTPN6 (4.79%)、 SUZ12(4.07%)（下图D）。在整合其他所有基因表达后，通过构建5个最重要基因的Partial dependence plot图，描述了基因表达如何影响早期疾病诊断概率（下图E）。

构建20个最重要基因的Partial dependence plot图，并将每个基因的最高表达水平与早期疾病阶段分类的概率进行比较，最近的研究将晚期MF疾病进展与SS联系在一起，特别是TOX，FYB，CD52和CCR4表达增加的时候，但是基于预测模型发现这些基因对预测没有较大的影响。具有预测早期疾病的高表达基因是FOXP3和PTPN6，预测晚期疾病的高表达基因是TGFB1、TGFB1和PTPN6。作者依据拟时序分析投影对Top20基因的表达进行了检验（下图B-D），发现PLS和SUZ12等基因在SS不同阶段具有不同表达模式（下图C），晚期疾病相关基因没有清晰的基因表达模式（下图D，橘色），而早期疾病相关基因在至少1个阶段中下调（下图D，灰色）。

结语

文章结果显示FOXP3⁺恶性T细胞在进化过程中由FOXP3⁺ T细胞过度为 GATA3⁺/ IKZF2⁺ (HELIOS)肿瘤细胞。克隆性肿瘤中的基因表达多样性可用于预测疾病阶段，作者筛选出预测疾病阶段的基因，准确度接近80％，发现FOXP3是预测SS早期疾病的最重要因素，连同另外19基因个用于预测CTCL分期。此项研究为理解SS的异质性提供了助力，有助于更好的理解克隆性肿瘤内基因表达多样性。 这种转录异质性可以预测肿瘤分期，从而为治疗提供指导。

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