10X Genomics单细胞转录组技术流程和优势

Original Lyric 联川生物 2022-05-21

收录于合集 #单细胞 337个

作为单细胞测序的一个重要里程碑，10x genomic公司于2016年2月推出10x Chromium Single Cell Gene Expression Solution，此平台整合了仪器、试剂盒和信息学软件，能全面对接illumina测序仪，因此可实现大量大细胞的快速高效标记、测序和分析，获得单细胞水平的基因表达谱和差异情况，并通过对复杂细胞群体进行深入细致分析，绘制大规模单细胞表达图谱。

110X Genomics技术流程

介绍10X Genomics技术流程前，首先介绍Gel bead（凝胶磁珠）。Gel bead由凝胶珠和磁珠上的一段引物构成，引物序列构成依次为：全长Illumina TruSeq Read 1 测序引物、16nt 10X Barcode序列（每个Gel bead的10X Barcode均不相同，形成GEM（Gel Beads-in-emulsion）后用于区分细胞）、12 nt unique molecular identifier (UMI) （区分同一细胞的不同转录本并去除PCR Duplications，实现绝对定量）、30 nt poly dT反转录引物。

图1 Gel bead结构

技术流程

1.制备好的细胞悬液、10X barcode凝胶磁珠和油滴分别加入到Chromium Chip B的不同小室（下图左），经由微流体“双十字”交叉系统形成GEM（下图右）。为了获得单细胞反应体系，细胞悬液浓度建议控制在700-1200细胞/ul，因此产生的90-99% GEM不含有细胞，剩下的大部分GEM含有一个细胞；

2.单个GEM依次形成后再全部混合，细胞裂解，凝胶珠自动溶解释放大量引物序列；

3.释放的引物中包含30nt poly dT反转录引物，带有polyA的RNA被反转录为带有10X Barcode和UMI信息的cDNA一链，再以SMART方式完成二链合成；

4.油滴破碎，磁珠纯化cDNA一链，然后PCR扩增cDNA；

5.cDNA扩增完成后酶切片段化并磁珠筛选最适片段，通过末端修复、加A、接头连接Read2测序引物，再以PCR方式构建含有P5和P7接头的cDNA文库；

6.最后构建的文库结构如下；

210X Genomics技术参数及优势

1.真正单细胞测序

10x genomics技术原理类似于Drop-seq，平台利用微流体“双十字”交叉系统分选单个细胞，通过barcode磁珠-单细胞-油滴的对应关系形成GEM（Gel Beads-in-emulsion），实现真正意义上的单细胞测序。

2.超高细胞通量

微流体“双十字”交叉系统为8通道系统，每个通道最高可捕获10000细胞，8通道一次可检测细胞范围为500-80000个细胞。

3.细胞捕获效率高

单个细胞捕获效率高达65%，可准确鉴别稀有细胞类型，利于稀有样本或小细胞量类型样本研究。