Nature：脂肪细胞的“叛徒”——脂肪细胞调控脂肪形成 | 10×单细胞案例解析

文章信息

论文标题：A stromal cell population that inhibits adipogenesis in mammalian fat depots

刊登日期：2018年7月

发表杂志：Nature

影响因子：41.577

研究机构：瑞士洛桑联邦理工学院的Bart Deplancke课题组、苏黎世联邦理工学院Christian Wolfrum课题组、瑞士干细胞基金会的Gianni Soldati

技术手段：单细胞测序（10X Chromium、Fluidigm C1）、RNA-seq、qPCR、流式分选、成脂分化诱导、Transwell

前言

脂肪细胞一旦分化，它们就会逐渐停止分裂，实行脂肪储存的功能。但是大部分超重患者体内脂肪细胞数量有限，停止分裂的脂肪细胞为了储存脂肪而体积变大，直到容纳的脂肪超出其承受上限而将脂肪排到血液，血液中的脂肪会累积在肌肉和肝脏中，影响健康，所以脂肪细胞的发育和分化在肥胖症及其并发症的病因学中具有重要意义。尽管一些研究表明脂肪干细胞和脂肪前体细胞可以产生成熟脂肪细胞，但对它们的体内起源和特性的理解还不完整，部分原因是他们的高度异质性和脂肪库的非结构特性，所以采用经典的分选方式（例如流式分选）无法将它们区分。

本想研究中，研究人员采用单细胞转录组技术对小鼠皮下脂肪基质血管部分（stromal vascular fraction，SVF）脂肪干细胞和前体细胞不同亚群进行了分析，鉴定到了一个不仅不能分化成脂肪细胞、还可以在体内/体外以旁分泌形式抑制脂肪细胞生成的细胞亚群，命名为脂肪生成调节细胞（Adipogenesis regulates cells，Aregs）。这项研究指出了Aregs的潜在关键作用：调节脂肪组织的可塑性，提高控制肥胖和胰岛素耐受的能力，从而治疗包括2型糖尿病在内的代谢疾病。

文章思路

研究内容

为了研究脂肪干细胞和前体细胞（adipogenic stem and precursor cells，ASPCs）的群体结构，首先从SVF中分选Lin⁻(CD31⁻CD45⁻TER119⁻)CD29⁺CD34⁺SCA1⁺细胞并做单细胞测序（Fluidigm C1）。获得的208个细胞依照基因表达谱被分成3个群体（P1、P2、P3）。

三个群体中，P2细胞群体特异表达基因涉及脂肪生成，包括脂肪形成监管基因Pparg，进一步分析谱系标志基因发现，只有Fabp4 (与脂肪形成相关)在不同细胞间显著差异表达且在P2细胞群体中高表达，另外P2细胞群体中脂肪含量显著高于P1和P3。已报道的前体脂肪细胞标志基因中，Pparg和Prdm16在P2群体表达高表达，并与Fabp4正相关。

为了进一步确认检测到的3个细胞群体，研究人员采用10X Chromium单细胞转录组测序技术对大量Lin^- SVF细胞（1804个细胞）进行了分析，发现绝大部分细胞处于ASPC状态，即Itgb1 (编码CD29), Cd34 、Ly6a (编码SCA1) 高表达，而成熟脂肪细胞标志基因Adipoq、Retn、 Cidec基本不表达。所有细胞可以聚类成4个亚群（G1-G4），G1和G4相当于P1，G2相当与P2，G3相当于P3。

总之，利用两种不同的单细胞测序平台，在Lin⁻ SVF细胞中共鉴定到3个细胞群体，一个群体干细胞特异基因（Cd34、Ly6a）高表达（G1、G4或P1），另一个群体脂肪前体细胞特异基因（Fabp4、 Pparg、Cd36）高表达（G2/P2），这两个群体细胞占所有细胞比例超过90%，第三个群体为G3/P3群体。

依照单细胞分析结果，作者选择不同细胞群体中的标志基因：Cd55和 Il13ra1 (P1、G1和G4)、Aoc3 (编码VAP1)和Adam12 (P2、G2)、 F3 (编码CD142)和Abcg1 (P3、G3)，并使用流式分选。鸡尾酒法分别诱导白色脂肪分化，发现P2群体细胞脂肪形成没有变化，P1群体细胞形成脂肪细胞的趋势增加而P3群体细胞形成脂肪细胞的趋势降低（下图d、e），同样的，脂肪形成标志基因在不同群体的表达变化趋势也一致：在P1高表达，在P3低表达（下图f）。而且没有一个细胞群体表现出明显的细胞核数量差异（下图g），表示脂肪形成差异不是由于细胞数量变化引起。

其他ASPCs细胞相比，CD142⁻ABCG1⁻ 和CD142⁻ ASPCs (后续会转化为CD142⁻ABCG1⁻ASPCs)显示出更明显的脂肪分化差异，侧面证明P3细胞（CD142⁺ABCG1⁺ ）自身可以抑制脂肪形成（抑制成脂分化）。

CD142⁺ABCG1⁺ ASPCs和CD142^-ABCG1^- ASPCs按照不同比例混合，发现成脂分化降低幅度比预期降低幅度更大，进一步证明P3细胞可以抑制脂肪形成。并且不同混合比例样本中，成脂诱导前后P3细胞数量没有发生明显减少，表示成脂分化的改变和细胞数量不相关。

以上数据表明，ASPCs中高表达CD142和ABCG1的亚群（P3）自身不能分化为脂肪细胞，并且负调控其他ASPCs分化为脂肪细胞，因此这一类细胞被命名为脂肪生成调节细胞（Adipogenesis regulates cells，Aregs）。

为了研究Aregs表达谱特征，分别在4个时间点（D0、H5、D1、D12）取CD142⁺ ASPCs 和CD142⁻ ASPCs并做转录组测序（RNA-seq）（下图上），成脂分化诱导后成脂相关的基因（Pparg、Fasn、Fabp4、Lpl 、Fabp12）在Aregs明显低表达（下图下）。

ASPCs, CD142⁻ASPCs和CD142⁺ ASPCs 分别和ASPCs在Transwell中共培养，成脂分化诱导后后发现，与三类细胞共培养的ASPCs成脂能力依次降低，表明CD142⁺ASPCs可以通过旁分泌形式抑制其他ASPCs脂肪形成。

为了确认哪些基因参与了旁分泌方式抑制其他ASPCs脂肪形成过程，作者选择了CD142⁺/ CD142^- 上调且在成熟脂肪细胞低表达的23个基因，利用siRNA敲低他们的表达量，其中Rtp3、 Spink2、Fgf12、Vit表达降低后可以显著提高SVF细胞成脂能力，同时不影响细胞数量，表示这些基因可能参与调节Aregs的成脂抑制能力。

Transwell实验进一步确认，和野生型Aregs相比，基因敲除后的Aregs对CD142^– ASPCs的成脂抑制能力降低，Rtp3降低效果最小，Spink2和 Vit降低效果最大。

为了确认人Aregs和小鼠Aregs是否具有类似的特性，流式分选人Aregs后PCR检测相应基因表达，F3（CD142）高表达但ABCG1中表达（下图左），人CD142⁺细胞和人CD142^– 细胞分开培养后诱导成脂，诱导后CD142⁺细胞中成熟脂肪细胞标志基因低表达（下图右），表明Aregs具有脂肪细胞的低分化潜能。

将ASPCs、CD142^– ASPCs、CD142⁺ ASPCs分别培养并成脂诱导，活体外（ex vivo）和体外（in vitro）实验据表明CD142⁺ ASPCs成脂能力最低，且CD142⁺ ASPCs缺失时，和ASPCs相比CD142^– ASPCs成脂能力提高（下图a-d），表明人Aregs也具有对其他ASPCs的成脂抑制能力。

小鼠皮下脂肪组织冷冻切片免疫荧光染色显示，CD142免疫荧光出现在血管周鞘脂肪组织独立的细胞中而不是在淋巴结中；整合CD142信号和SCA1信号，发现CD142⁺SCA1⁺细胞定位在血管周鞘且占比较小，作者推测CD142⁺SCA1⁺细胞对应Aregs。

使用流式分选发现Aregs同样存在于内脏脂肪中，且内脏SVF中Aregs比例高于皮下SVF中Aregs比例，另外肥胖小鼠Aregs含量高于纤瘦鼠（下图e）。为了验证体内Aregs在体内是否具有抗脂肪形成能力，分别将（1）SVF细胞、CD142⁻ABCG1⁻SVF细胞、（2）Lin⁻SCA1⁺细胞、CD142⁻Lin⁻SCA1⁺ SVF细胞定植于基底膜后分别注入小鼠腹部左右皮下层，然后用高脂饲料喂养荷瘤小鼠三周诱导脂肪生成，比较发现不管是SVF细胞还是ASPCs，缺失Aregs后行程更多数量的成熟脂肪细胞，并且植入的底膜外观有更多外露白点（下图f-h）。这些研究结果表明Aregs在体内控制着成熟脂肪细胞的形成。

这项发现表明，人体内还有许多细胞类型有待发现，其中不乏一些对医学有重要意义的细胞，正如在这项研究中所发现的Aregs。—Christian Wolfrum说

控制脂肪细胞形成不仅对改善新陈代谢健康很重要，对减缓衰老也很重要。因为一些组织，比如骨髓和肌肉，随着年龄增加也会积累越来越多脂肪，对自身功能产生负面影响，这些新增加的脂肪可能也会受到Aregs样细胞调控。我们现在迫不及待地想进一步了解这些有趣的细胞，可以预见的是它将产生广泛的生物学意义。—Bart Deplancke说

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