代谢组学助力PNAS | 空间代谢组学在癌症研究中的应用

期刊：PNAS作者：Chenglong Suna, Tiegang Lia, Xiaowei Songa et al.发表日期：2019年1月IF：9.58引言研究肿瘤代谢的空间信息对癌症的靶向治疗具有重要意义。中国医学科学院和北京协和医学院研究人员利用AFADESI-MSI技术对256个食管鳞状细胞癌组织样品进行研究，并利用原位代谢组学数据分析，提供了众多具有重要参考价值的肿瘤相关的代谢通路信息，包括：脯氨酸生物合成、谷氨酰胺代谢、尿苷代谢、组氨酸代谢、脂肪酸生物合成以及多胺生物合成等在肿瘤发生中具有重要作用的代谢通路。研究背景组织癌变使得相关部位的代谢途径发生改变，对不同类型癌症研究了解其依赖性代谢通路，对癌变组织类型的鉴定、分子机理的认知具有重要意义。选用合适的研究手段研究癌变代谢酶的改变有助于肿瘤的靶向治疗。LC-MS技术能够显示蛋白表达的变化，但是样品前处理会使其空间分布特征丢失。MALDI-MSI技术能有效保留蛋白和代谢物的空间分布特征，但是实验要求高真空环境以及辅助基质。IHC作为酶空间分布及表达强度检测的传统手段，能够对特定的酶进行有效检测，但是却无法用于对大量特征未知酶的研究。以DESI-MSI为代表的AMSI技术能够对组织切片内的分子特征进行有效分析，而且在肿瘤临床研究中的得到有效验证——能够有效检测肿瘤组织中脂质异常代谢。本文作者所在课题组通过改进该技术，利用AFADESI-MSI对256个食管鳞状细胞癌（ESCC）患者癌变组织研究得到相应的区域特异性的代谢图谱，通过分析鉴别癌变组织与正常组织间的差异代谢物，进一步分析发现了差异代谢物主要参与的信号通路以及密切相关的酶。主要包括脯氨酸生物合成、谷氨酰胺代谢、尿苷代谢、组氨酸代谢、脂肪酸生物合成以及多胺生物合成等信号通路以及PYCR2、GLS、UPase1、HDC、FASN、ODC等直接参与前述信号通路的酶。结果展示

1.分子空间分布特征剖析

研究者将ESCC组织划分为癌组织（cancer tissue，CT）、上皮组织（epithelial tissue，ET）、肌肉组织（muscular tissue，MT）三个不同的组织区域。然后合并MSI和H&E图像使得能在不同组织区域对不同代谢物的表达特征进行观察（图1A）。结果显示，不同区域质谱谱型具有明显不同，众多代谢物在不同区域具有明显差异，最大差异达到1000倍以上（图1C）。通过构建PLS-DA模型（图1B）并联合多元统计分析，研究者找到了大量在不同部位显著差异性表达的小分子代谢物及脂类物质（图2），例如：甘油磷酸胆碱、甘油磷酰乙醇胺、磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇、磷脂酰丝氨酸。图1 不同ESCC特定组织区域MS质谱图
（A）显微/质谱重叠图像。（A1）ESCC组织的H＆E图像。（A2）谷氨酸（m / z 146.0459）MS图像。（A3）显微镜-MSI叠加图像。（B）正离子模式（B1）和负离子模式（B2）PLS-DA的模型。（C）正离子模式下癌组织（C1），肌肉组织（C2）和上皮组织（C3）的代表性质谱图。图2 ESCC组织切片区域特异性MS图像

GPC 甘油磷酸胆碱；GPE 甘油磷酰乙醇胺；PC 磷脂酰胆碱；PE 磷脂酰乙醇胺；PI 磷脂酰肌醇；PS 磷脂酰丝氨酸。

2. 肿瘤相关代谢通路探索

研究人员利用KEGG网站辅助分析差异代谢物参与的信号通路，结果显示差异代谢物主要集中在精氨酸/脯氨酸代谢、脂肪酸生物合成、丙氨酸/丙氨酸/谷氨酸代谢、嘧啶代谢、组氨酸代谢等信号通路（附图S4）。研究者选用与前述信号通路密切相关的代谢酶研究这些酶在ESCC发生中是否具有重要作用，包括：PYCR2、GLS、UPase1、HDC、FASN、ODC。附图S4 代谢通路分析
附表2 ESCC潜在关联酶信息

3.  肿瘤相关代谢途径关键代谢产物和代谢酶的原位验证

脯氨酸（Pro）参与广泛参与各种生命活动：细胞凋亡、自噬等，同时也能参与癌症发生。研究显示，Pro在癌组织中的含量显著升高（图3A、3C）。PYCR2作为Pro生物合成通路的限速酶，可以通过IHC染色显示PYCR2 的空间表达模式，从而进一步验证质谱数据。结果显示，PYCR2主要在ESCC癌变区域内表达。作者同样对Pro含量没有发生改变的肿瘤组织内PYCR2进行检测，结果显示，PYCR2含量在不同样品中同样持平（附图S6）。图3 脯氨酸的生物合成途径关键代谢产物和代谢酶的原位检测
（A）脯氨酸的MS图像。（B）MSI和H＆E重叠图像。（C）256名ESCC患者癌组织以及对应的上皮和肌肉中脯氨酸的水平（平均值±SD）。*** P ＜0.001。（D）食管鳞癌组织切片H＆E图片。（E）PYCR2在ESCC组织切片不同区域的表达。CT：癌组织；ET：上皮组织；MT：肌肉组织。附图 S6 肿瘤组织代谢物和相应酶的空间分布
（A）显微/MSI重叠图像和肿瘤中不同区域标识。（B）PYCR2、Pro、GLS、Glu/Gln在不同区域中表达统计。（C）肿瘤切片在不同区域PYCR2  IHC染色的代表性图片（200×）。 同样，研究者同时对富集到的其它信号通路代谢物及其限速酶进行检测，Gln/GLS、尿苷/UPase1、组胺/HDC、FA/FASN的表达量在癌变组织中均发生显著变化（图4,5）。Gln能参与细胞能量代谢、核苷酸、氨基酸生物合成、氧化还原反应等众多生命活动，肿瘤细胞的生长对Gln具有极强的依赖性。尿苷是RNA合成的重要前体物质，同时也能参与嘌呤核苷酸和糖类代谢。也有文章指出尿苷平衡被破坏以后能诱发p53介导的DNA破坏从而使细胞发生癌变。组胺直接参与癌症发生，与癌细胞DNA损害、衰老、凋亡紧密相关。脂肪酸作为内源性小分子，广泛参与能量代谢和信号转导。癌细胞能快速产生脂肪酸以满足细胞膜形成、信号转导和能量消耗。图4 谷氨酰胺代谢途径关键代谢产物和代谢酶的原位检测图5尿苷（A）和组氨酸（B）代谢途径关键代谢产物和代谢酶的原位检测总结研究者利用改进后的质谱仪发展了空间代谢组学研究手段，高通量检测肿瘤相关的代谢物及关键酶，并用IHC技术手段对分析结果进行验证，加深了对肿瘤发生相关代谢调控网络的了解，为ESCC的治疗提供了大量的参考依据。拓展阅读—质谱成像技术以质谱为基础的成像方法不局限于特异的一种或者几种蛋白质分子，可在组织切片中找到每一种代谢离子,并提供这些代谢离子在组织中的空间分布的精确信息，而事先无需知道所检测代谢物的信息，不需要对待测物进行标记，分析物可以其最初的形态被检测，同时可对这些代谢离子含量进行相对定量，适用于研究生物分子的反应。质谱成像这种最新原位分析技术主要是利用质谱直接扫描生物样品，分析分子在细胞或组织中的“结构、 空间与时间分布”信息。常见技术手段有：1. 高分子物质检测—MALDI质谱分子成像技术。2. 无需样品处理实时成像一电喷雾电离技术。3. 活体成像—APIRMALDI/LAESI技术。4. 3D成像—二次离子质谱技术。5. 高灵敏度高分辨率—纳米结构启动质谱技术。相关阅读