肠道菌群和单细胞在一起就能发Nature？| 微生物专题

前段时间给大家介绍过一些高分肠道菌群的工作（《为什么别人的肠道菌群与结直肠癌关系研究能发Nature Medicine》、《我的领域文章众多，还能发高分文章吗，这篇Nature Microbiology文章会回答你的疑问》、《Nat Med：肠道菌群–胆汁酸–白介素22轴协同调节多囊卵巢综合征》），本期再给大家介绍一个肠道菌群的高阶玩法——肠道菌群搭配单细胞，将机制阐释深度再上一个台阶。这个高阶玩法的思路来自2019年10月Nature上发表的一项研究《The microbiota regulate neuronal function and fear extinction learning》，研究人员通过小鼠实验发现，肠道菌群的变化会通过肠-脑轴改变大脑神经元的功能和结构，进而影响动物的恐惧消退学习[1]。

这个研究从五个维度对肠道菌群介导恐惧消退学习的关键作用和机制展开系统剖析。下面我们逐一来看每个维度的探讨是如何展开的，它们之间又是如何层层递进的。

1行为学水平——肠道菌群缺乏介导恐惧记忆消退许多临床和流行病学研究已发现，肠道菌群的变化与多种神经精神病学疾病相关（我们之前也介绍过肠道菌群与自闭症、精神分裂症等精神疾病存在关联）。恐惧消退异常与肠道菌群很可能也存在着关联。为此，作者采用经典恐惧条件反射和消退模型，检测对照小鼠和抗生素（ABX）清除菌群的小鼠之间的区别。实验发现，与对照小鼠相比，ABX小鼠恐惧条件发射反应正常，但是恐惧消退学习异常。类似的结果也出现在无菌（GF）小鼠中。这些结果说明，肠道菌群是恐惧记忆消除的决定因素之一。图1 ABX和GF小鼠不易消除恐惧

2转录组水平——恐惧消退学习会使mPFC转录组发生显著变化恐惧消退异常归根结底来自于大脑，肠道菌群缺乏又是如何对大脑产生影响？大脑的前额叶皮质（mPFC）是恐惧消退依赖的关键脑区，作者对对照小鼠和ABX小鼠的mPFC组织进行RNA-seq，发现未进行任何处理的ABX小鼠和正常小鼠mPFC的转录组没有明显差异，然而恐惧消退学习却会使两者的转录组发生显著的差异。通过STRING， KEGG和GO等数据库分析差异基因，发现这些基因富集的通路是神经元活动、突触功能、中枢神经系统成熟及突触可塑性调节，以及突触后树突棘发育等。图2 恐惧消退学习会使mPFC转录组发生显著变化

3单细胞水平——小胶质细胞异常可能导致了恐惧消退学习缺陷为找到mPFC中哪些细胞群在肠道菌群影响恐惧消退学习中发挥作用，作者对恐惧消退学习后的ABX和对照小鼠的mPFC进行单细胞核RNA测序(snRNA-seq)，鉴定出24个细胞簇。分析发现肠道菌群变化与多个细胞簇中的基因表达变化相关。在神经元细胞簇中，兴奋性神经元比抑制性神经元受到的影响更大。星形胶质细胞，髓鞘少突胶质细胞和小胶质细胞的基因表达发生了明显变化。小胶质细胞可以动态调节突触修剪并监测其局部微环境，这对维持神经功能和大脑健康很重要，并有报道它们会受到菌群的影响。作者对小胶质细胞的差异表达基因做了进一步的分析，发现它们富集到的通路与突触组织和突触组装相关，这表明人为操纵菌群可能会改变小胶质细胞介导的突触修剪。同时还发现一些与细胞未成熟状态相关的基因在GF和ABX小鼠中表达水平很高。综合起来，GF和ABX小鼠的小胶质细胞表现出一种不成熟的状态，这可能反过来通过破坏树突棘重塑进而导致消退学习的缺陷。
图3 单细胞测序揭示小胶质细胞异常可能导致了恐惧消退学习缺陷

4组织学水平——恐惧消退学习异常与突触后树突棘变化相关有报道突触后树突棘是树突上的膜状突起，在学习记忆过程中，会发生动态变化。作者通过双光子激光扫描电镜技术发现，与对照小鼠相比，ABX小鼠的树突棘消失速率明显升高，而形成速率则没有明显变化。并且，恐惧条件反射模型下，两种小鼠没有明显区别，而恐惧消退模型下，二者区别明显，对照小鼠的树突棘形成速率增加，而ABX小鼠变化不大；对照小鼠的树突棘消失速率变化不大，但ABX小鼠持续增加。这些结果表明，菌群所导致的恐惧消退学习异常与突触后树突棘变化相关。
图4 恐惧消退学习异常与突触后树突棘变化相关
5代谢组水平——肠道菌群可能通过4种代谢物影响恐惧消退学习最后作者猜测肠道菌群是通过代谢物来影响大脑的神经元与小胶质细胞。通过LC-MS对小鼠脑脊液、血清和粪便样本进行非靶向代谢组检测，发现与对照小鼠相比，GF小鼠中4种代谢物——硫酸苯酯、硫酸邻苯二酚、3-(3-磺酰氧基苯基)丙酸（前三种都是酚类化合物）、和硫酸吲哚酚显著降低。3-(3-羟基苯基)3-羟基丙酸（3-(3-磺酰氧基苯基)丙酸的衍生物）和硫酸吲哚酚已被证实与神经精神疾病有关，如人类执行功能受损、精神分裂症和自闭症。据报道，菌群产生的酚类化合物，如 4-乙基苯基硫酸盐，会影响小鼠的自闭症相关的行为，这表明菌群产生的化合物可能在多种环境下对神经元的发育和功能具有保守的作用。（编者注：代谢组已成为研究肠道菌群与疾病的关联性或是因果性的标配，不管是10分以上还是以下的文章大多会包含粪便和/或体液的代谢组检测。）图5 肠道菌群可能通过4种代谢物影响恐惧消退学习
最后用下图来呈现肠道菌群调节神经元功能和恐惧消退学习的机制[2]。图6 肠道菌群通过代谢物调节小鼠恐惧消退学习
编者说围绕肠道菌群调节神经元功能和恐惧消退学习，作者从五个维度逐级深入地串起了一条令人信服的证据链，并借助代谢组数据为整个Story形成了一个闭环。本文将看似独立的两个研究对象——肠道菌群和单细胞，巧妙且合理地结合在一起，发现肠道菌群可能是通过小胶质细胞的不成熟来破坏树突棘重塑进而导致消退学习的缺陷。再配合组织学成像等实验证据深度论证了肠道菌群对神经元的调节功能。本研究可作为深度解析肠道菌群是如何发挥功能的非常好的范例。思路拓展一下，肠道菌群是不是也能和m6A、翻译组、… …在一起搞事情呢。参考文献：
[1] Chu C, et al. The microbiota regulate neuronal function and fear extinction learning. Nature. 2019, 574(7779): 543-548.[2] Kiraly DD. Gut microbes help mice forget their fear. Nature. 2019, 574(7779): 488-489.相关阅读土壤微生态的五大研究方向 |cell 子刊综述解读助力微生物组研究Microbiome：不同严重程度的冠心病可用肠道菌群和代谢组来鉴别 | 微生物专题
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