微生物组学在肿瘤研究中的新思路 | 微生物专题

本文来自首届新型标志物前沿技术与肿瘤精准治疗新进展钱塘论坛（2019.11.29~12.01）上的发言稿。本报告介绍了微生物组在人类健康与疾病研究中的最新进展和观点，特别是在肿瘤研究中。并结合我们多年来在做微生物组检测服务中的体会和思考，和大家共同探讨微生物组研究的新思路。

微生物，特别是人体微生物，之于人类的重要性已众所周知。经过亿万年的进化选择，我们身体中共生着数量庞大的微生物，这些微生物生活在包括口腔、消化道、胃肠道、泌尿生殖道、皮肤等部位。人体为这些微生物提供了一个受保护的、温暖的、营养丰富的微环境，可容纳它们生长，而微生物，比如肠道菌群会帮助人类消化复杂的碳水化合物，产生我们可以吸收的物质，比如维生素等，同时它们会占据生态位，不让病原微生物定植，这也是对人体健康的一种保护。在目前已知的人体微生物中，我们研究最多了解最多的是肠道菌群，因为大部分的菌群都生活在肠道中，肠道菌群承担着人体非常重要的病理生理作用，包括调节能量摄入、产生重要代谢产物、参与炎性反应和调节免疫功能等。

我们看图中右边绿色部分，当人体摄入膳食纤维、益生菌等有益物质，经过肠道菌群的消化，会产生对人体有益的代谢物，如短链脂肪酸、抗氧化物等，这些代谢物会促进脂肪代谢、减少肠道炎症，增加胰岛素敏感性等，帮助人体保持健康状态。当人体摄入过多的蛋白质、糖、饱和脂肪酸、以及抗生素等（图中左边红色部分），就会使肠道菌群产生更多的氧化三甲胺、更多的脂多糖，而有益的短链脂肪酸产量下降，这会增加心血管疾病的风险、产生肠道炎症、增加胰岛素抗性，这时人体会往疾病状态发展。

我们遇到一些课题组老师问，我不研究肠道疾病，是不是就研究不了肠道菌群了。这肯定不是。紊乱的肠道菌群不但影响肠道的健康，而且它们的有害代谢物还可以通过肠脑轴、肠肝轴等多种途径，影响到肠道外器官的正常状态。已有非常多的报道证实，肠道菌群紊乱与心血管病、肝病、神经系统疾病、皮肤病等紧密相关。前段我们公众号上发的一篇文章（如何用肠道微生物组鉴定原因不明疾病的分子标志物 | 微生物专题 ），还是讨论致病机理尚不明确的纤维肌痛症与肠道菌群的关系。大家可以关注下。

正是因为肠道菌群的重要性，关于肠道菌群的研究近年来一直是研究的热点，也是国自然资助的重点方向，热度持续升高，截至目前总计有超过19000篇相关的研究报道，2019年还有一个月结束，目前肠道菌群的文献已突破5000篇，足见国内外学者对肠道菌群研究的重视程度和浓厚兴趣。我们再来看右边的数据比较，即使拿目前关注度非常高的单细胞转录组来做比较，来自肠道菌群研究的高分文献数量也不落下风。肠道菌群研究是一个可高可低，既能轻松发5分内文章，也能深入探讨机制发到CNS主刊的研究内容。

说到了微生物组、肠道菌群研究的高热度，也给大家简要介绍下微生物组研究的方法。2018年有一篇重量级的综述，来自UCSD的微生物组大神Rob Knight，这篇综述详细介绍了从实验设计、样本收集、检测工具、数据分析、以及多组学关联分析等角度微生物组研究的最佳方法（Nature Reviews Microbiology：分析微生物组的最佳实践 | 全文解读 ）。不管你是微生物组研究的老司机，还是刚开始做这个方面研究的新人，我都非常推荐你仔细读一读，肯定会有收获。右图是Rob建议的微生物组检测流程，左侧的分支是通过扩增子测序，也就是我们常说的16S测序、ITS测序进行菌群多样性分析。Rob特别提到应该采用去噪的算法进行序列分析（红框框出），即以100%的序列相似度而非97%的相似度（传统的OTU分析方法）进行序列聚类，只有这样才能更加准确地进行菌群定性和定量。我们的扩增子测序分析流程已全面升级到最新的QIIME 2流程，采用Rob推荐的100%序列相似度进行聚类和分析（发微生物组16S测序高分文章，四招让你事半功倍 | 微生物专题）。进行微生物组功能分析，采用宏基因组测序。这里要提一下，宏基因组测序比16S测序能鉴定出更多的细菌物种（species），有时甚至可以到株（strain）水平。虽然16S测序也能鉴定出一些细菌物种，但是通常我们只讨论到属（genus）水平。对于微生物组研究，我们能鉴定到细菌分类越精细越有利于我们找到核心菌，不管是机制研究还是今后的临床转化，都非常重要。检测菌群的基因表达情况，采用宏转录组测序。可以根据具体的需求，选择其中一种或多种检测方法开展微生物组实验。

有了前面的铺垫，我们接下来站在巨人的肩膀上，看看国际国内的专家对微生物组在癌症发生中作用的最新看法和观点。在今年5月，一份微生物组在癌症发生中的作用的共识声明发表在Gut上。这份声明出自国际癌症微生物组协会，一个由18人组成的国际专家组，他们来自肿瘤学和微生物学，中国香港中文大学的于君教授也是这个专家组的一员。5月份，联川作为智库专家受邀出席2019中国肠道大会，我有幸听到了于君教授关于肠道菌群与结直肠肿瘤关系的大会报告，于教授对微生物组与消化道肿瘤的关系研究上建树颇丰。

这项共识声明是围绕着回答微生物组致癌作用的5个关键问题展开，这5个问题也是各位老师开展微生物组研究需要面对的核心问题。在座的老师，应该也有一些正在进行微生物组致癌作用的研究，你对这些问题是怎么看？

我们逐一来看，国际专家组对这些问题达成的看法和观点。

专家组建议大家需要谨慎使用微生态失调（dysbiosis），因为目前，我们还没有公认的正常微生物组的定量定义，不知道正常微生物组的样子，何谈失调。如果要说微生态失调，应限制在一个特定的范围内来说。关于致癌作用，专家组认为微生态失调应该被认为是宿主微生物从健康相关的、稳态的状态向促进和/或维持癌症表型的一种持续偏离。

微生物组可能参与癌症发病的广泛分子机制主要有5种：基因组整合、遗传毒性、炎症、免疫、代谢。其中通过炎症和代谢途径是微生物组影响宿主的主要方式。

关于第三个问题，目前并没有完美的概念框架来做解释。在结直肠癌的发病机制中，driver-passenger模型可以解释从机制研究，以及肿瘤上与肿瘤外微生物组调查中得到的关键结果。然而对于其他肿瘤，这个模型并不一定奏效。专家组认为，微生物组在癌症发病机制中的作用可被概念化为与环境、表观/遗传易受攻击的宿主构成的一个三方、多向相互作用组（Interactome）的一方。

因果关系还是相关关系是讨论微生物组在肿瘤发病机制中作用的关键内容。在单一物种水平，微生物作为致癌物的作用已经得到了证实。然而，微生物组的致癌机制，目前只有少部分癌症中有证实存在因果性，更多的是一些看似合理的机制，有待更多实验证据来证实。

最后一个问题，是关于未来的研究方向，基于现有的研究，专家组给出5点建议：1）开展大型、国际队列研究，2）采用前瞻性纵向抽样，3）更多关注干预性研究，而不是纯粹的观察性研究，4）微生物组分析整合进肿瘤研究项目，5）标准化和透明地报道微生物组研究。

最后，国际癌症微生物组联盟关于人类微生物组致癌作用达成了上述共识。微生物组的致癌作用研究还有很长的路要走。

围绕专家组的共识和我们多年的微生物组服务经验，我们给出微生物组研究的5个思路。1）首先，目前国内老师开展横断面的微生物组研究居多，开展纵向研究的少。由于微生物组，比如肠道菌群，是动态变化的，对特定时点（或期间）和特定范围内人群中的微生物组与疾病关系进行表征，是无法得到微生物组在疾病中发挥作用的全貌。大型长期的纵向队列研究是深度揭示微生物组作用的基础。2）只观察疾病状态下微生物组的变化是不够的，如分析在服用膳食纤维或是药物治疗后肠道菌群的变化，以及与疾病的作用关系，才能对我们以后管控肠道菌群提供参照和信息。3）正如共识所说，微生物组只是三方相互作用组中的一方，讨论微生物组功能，不能离开环境和宿主。4）从目前文献中的研究趋势看，单一的微生物组分析（扩增子测序或/和宏基因组测序）已显不足，多组学的联合分析，特别是代谢组和微生物组的联合已经成为微生物组与疾病关系分析的标准配置。我们的公众号上有许多多组学联合分析的例子，各位老师可以去查看了解。5）由于深入开展微生物组与疾病的相互关系目前仍有较大的难度和复杂性，许多工作止步于相关性的论证。相信随着实验和分析方法的进步，会有更多的研究工作将继续往因果性的方向前进。目前10分以内的工作，大多讨论的是微生物组与疾病的相关性，10分以上的工作，大多有开展不同程度的因果性论证。

向大家报告下，我们在大队列多组学数据分析上做的一些工作。为应对我们接到的队列项目的多组学大数据关联分析要求，以及微生物组高分研究的趋势，我们参照Nature Protocols上组学数据整合分析的策略，开发出专门针对微生物组与代谢组数据关联分析的算法——ACGT101_metaomics。

使用这个算法，我们可以帮助老师从海量的多组学数据中快速找到核心菌和关键代谢物，大幅提升数据分析效率。这个算法已在多项肠道菌群的大队列多组学关联分析项目中应用，分析结果非常好。

因为时间关系，这里不展开介绍我们参与完成的肿瘤及疾病相关的微生物组项目情况。我们已经把这些项目以及高分微生物组文献中的研究思路剖析出来，发布在了我们的公众号上，方便大家查看和参考。

更多微生物组研究思路解析，请关注公众号每周推送的文章

除了这些成熟的研究思路和方法外，最近发表的一些微生物组研究文献中的思路也值得大家参考。比如这篇10月份发表在Nature上的微生物群落调节神经元功能和恐惧消退学习的文章。这项研究从四个维度对微生物群落调节恐惧记忆消退展开分析。首先，从动物行为学实验发现，抗生素治疗的小鼠或是无菌小鼠，相比于对照组，恐惧记忆消退出现明显异常，表明，肠道菌群介导恐惧记忆消退。接着，恐惧来自于脑，目前认为它主要受前额叶皮层控制。.显微成像观察前额叶皮层的神经活动模式，发现抗生素治疗小鼠的突触可塑性受损。继续用单细胞测序来具体分析是前额叶皮层中的哪些细胞发生了变化，发现抗生素治疗小鼠的小胶质细胞在“发育方面”似乎存在问题，与细胞未成熟状态相关的基因表达水平很高。最后，肠道菌群又是如何介导恐惧记忆消退的呢？通过对小鼠脑脊液代谢组分析，发现4种代谢产物的水平发生了变化，明显低于对照组，而这些代谢产物的水平变化曾在人类精神分裂症和自闭症等精神疾病中出现过。综合这4个方面的发现，作者给出了肠道菌群介导恐惧记忆消退的可能机制。

微生物组在疾病、肿瘤发生中的作用非常值得深入揭示，相关研究成果具有重要的临床价值，更为重要的是，研究人体微生物组就是在研究我们自身。

我们已经为各位老师准备好了丰富的微生物组检测和分析方案。从实验设计、样本采集、检测方法、数据分析、以及多组学关联分析，我们都可以给老师提供帮助和指导。

在数据分析上，我们专门针对医学微生物组的研究特征和高分文献中的结果讨论，编写了医学版的16S测序报告（医学16S测序报告：为忙碌的医生而准备 | 微生物专题 ）和宏基因组报告（一份正经的宏基因组医学报告应该长这样 | 微生物专题）。这两份报告的最大特点是用故事逻辑取代传统的生信逻辑。所谓故事逻辑就是完全匹配的你的研究逻辑，也是匹配文献中的结果讨论逻辑（见下图）。

图 采用故事逻辑的16S测序报告结构

我们想要达到这样的效果，即使是刚入门微生物组研究的老师，也能无障碍的看懂实验结果，并且能够轻松地使用这些结果来撰写文章。此外，我们也提供云平台（http://www.lc-bio.cn/），方便老师灵活地开展个性化的数据分析和图表绘制。

最后我想用一张图来结束我的报告。这张图寓意着，微生物组研究的道路仍十分漫长，但是前途一定是光明的！

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