只做16S测序就发12分文章，怎么做到的？ | 微生物专题

免疫治疗（Immunotherapy）

免疫治疗自2018年获得诺贝尔生理学或医学奖之后愈来愈成为大家关注和探讨的热点。肿瘤的免疫治疗旨在激活人体免疫系统，依靠自身免疫机能杀灭癌细胞和肿瘤组织。随着免疫检查点的发现以及随之诞生的免疫检查点抑制剂（Immune Checkpoint Inhibitor，ICI），如CTLA-4和PD-1的抑制剂，它们已成功应用于多种癌症治疗，能够比传统的化疗等疗法显著延长患者的生存期。然而只有少数患者能够响应ICI并获得较好的治疗效果，目前已发现多种导致不响应的原因，其中就包括肠道菌群的影响[1,2]。下面要介绍的研究正是基于此，首次探讨了中国非小细胞肺癌（NSCLC）患者对ICI响应与肠道菌群之间的关系[3]。

发表期刊：Journal of Thoracic Oncology影响因子：12.46发表时间：2019研究内容：中国NSCLC患者对免疫检查点抑制剂治疗的响应与肠道菌群之间的关系样本数量：37名接受纳武单抗（Nivolumab）治疗的晚期NSCLC患者的粪便样本（基线，每次接受治疗前和疾病进展时）；在基线采集外周血样本。实验方法：16S rRNA基因测序+FACS检测外周血免疫细胞

实验设计：

起始有42位晚期（IIIB/IV）NSCLC患者接受Nivolumab治疗，最后37位患者完成测试。

采样时间点

治疗开始时采集，每2周Nivolumab输液前连续采集粪便样本。一旦病人出现疾病进展，就停止采集。

患者临床信息：

23名被评估为部分响应（n=5）或疾病稳定（n=18）的患者被归类为R（响应组），而其他（n=14）在第一次临床评估后疾病有进展被归类为NR（无响应组）。吸烟是唯一与Nivolumab反应相关的临床因素。

本研究探讨的科研问题：

Q1. 基线肠道菌群多样性是否会影响Nivolumab的治疗效果？

A1. 基线肠道菌群多样性与Nivolumab的疗效有关。

通过对受试者粪便的16S测序发现，在基线R组（n=13）肠道菌群α多样性显著高于NR组（n=12）（A）。在T1时间点，R组Shannon指数升高与基线时一致。然而，两组间的Inverse Simpson指数差异不显著，尽管趋势仍然存在（B）。通过Shannon指数将患者分为高多样性组和低多样性组。分析发现，与低多样性组相比，具有高多样性微生物群的患者的无进展生存期(Progression-Free Survival, PFS)显著延长(C)。R组和NR组的β多样性在基线时也有显著差异（D）。

图 R与NR组肠道菌群多样性比较

Q2. Nivolumab治疗是否对患者的肠道菌群产生影响？

A2. Nivolumab治疗对R和NR组肠道菌群的影响不同。

分析R组和NR组菌群的组成比例，发现拟杆菌门（Bacteroidetes）、厚壁菌门（Firmicutes）、变形菌门（Proteobacteria）和放线菌门（Actinobacteria）占细菌群落的大多数。但在门水平上，在基线或基线后R组和NR组之间没有统计学差异。在属水平上，鉴定出7种肠道细菌在基线水平上R组和NR组丰度不同（A）。未分类瘤胃球菌属（Ruminococcus_unclassified）在NR组中富集（B上），而Alistipes putredinis（B下），Prevotella copri，长双歧杆菌属（Bifidobacterium longum），毛形杆菌属（Lachnobacterium），毛螺菌科（Lachnospiraceae）和志贺氏菌属（Shigella）在R组中富集（A）。R组中长双歧杆菌属和Prevotella copri在基线和T1时间点均富集（C）。

图 R与NR组肠道菌群组成比较

Q3. Nivolumab多个周期治疗是否会改变患者的肠道菌群组成？

A3. Nivolumab治疗期间肠道菌群组成保持稳定。

ICI治疗过程中是否影响肠道菌群组成？Shannon指数从基线到不同评估时间点（T1到T8），以及在进展时间点都保持稳定（A左）。配对样本的Shannon指数在基线和T1（A中）或基线和进展时间点（A右）比较中没有差异。接着，在属水平比较10例配对粪便样本在基线和病情进展时间点的肠道菌群组成，发现也是相似的（B）。

进一步对10例患者的纵向样本的肠道菌群（7例来自R组，3例来自NR组）进行PCoA分析。在不同取样时间点的肠道微生物群样本聚集得很好，R组和NR组也被清晰地分离出来（C）。随着时间推移，主要的细菌门的相对丰度保持稳定（D）。R和NR组在基线有丰度差异的7个属，在治疗期间表现出轻微的扰动，但没有统计学上的差异（E）。

这些数据表明Nivolumab治疗不会改变晚期NSCLC患者的肠道菌群组成。

图 在治疗期间，肠道菌群分布保持稳定

Q4. 肠道菌群影响免疫治疗的可能途径？

A4. 肠道菌群影响免疫治疗可能是通过调节免疫细胞来实现。

由于肠道菌群可以通过调节系统免疫反应来部分地影响疾病进展，作者用流式细胞术分析了20例患者基线外周血T细胞和自然杀伤（Natural Killer, NK）细胞。用Spearman相关分析法分析免疫标志与微生物多样性的关系。Shannon多样性指数与多个CD8+T细胞和NK细胞标志呈正相关（A）。CD45RO+CD8+Tm细胞表达Ki-67、Tim-3和ICOS等特异性标志物与Shannon指数也有统计学相关性（B）。总NK细胞和PD-1+GZMB+NK细胞的百分率也与Shannon指数呈正相关（C）。比较高多样性组与低多样性组相关的免疫标志物水平，发现高多样性组中外周血GZMB+CD8+Tm，Ki67+CD8+Tm和CD8+Tcm的百分率显著升高（D）。这些结果表明，肠道菌群对抗PD-1治疗的影响可能与调节记忆T细胞响应和NK细胞功能有关。

小编对你说

这篇以肠道菌群16S数据讨论为主的临床文章，能发到12分，本人认为以下几个因素发挥了重要作用。1）抓住两大热点，肠道菌群和肿瘤免疫治疗；2）首创性，国内鲜有报道肠道菌群与肿瘤免疫治疗疗效关系的研究，本研究首次报道了肠道菌群在晚期NSCLC免疫治疗中的作用；同在7月，国内另一篇讨论肠道菌群在肝癌免疫治疗中的作用的文章发在《Journal for ImmunoTherapy of Cancer》，研究思路基本相同；3）大量可招募的受试人群，严谨的设计和规范化实验，以及详实的临床数据和随访。这是隐藏在文章背后的功夫，想要开展类似研究的课题组需要做好准备。

参考文献

1. Sivan A, Corrales L, Hubert N, et al. Commensal Bifidobacterium promotes antitumor immunity and facilitates anti–PD-L1 efficacy. Science, 2015, 350(6264): 1084-1089.
2. Vétizou M, Pitt J M, Daillère R, et al. Anticancer immunotherapy by CTLA-4 blockade relies on the gut microbiota. Science, 2015, 350(6264): 1079-1084.
3. Jin Y, et al. The diversity of gut microbiome is associated with favorable responses to anti-PD-1 immunotherapy in Chinese non-small cell lung cancer patients. J Thorac Oncol. 2019, 14(8):1378-1389.

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