5500字带新手吃透一篇典型肠道菌群文章的做法 | 微生物专题

最近遇到不少医院老师对肠道菌群很感兴趣，可因为刚接触不久，对肠道菌群与疾病关系的研究思路知道不多，想开展又不知怎样着手。为此，特选取近期一篇研究思路很具代表性的肠道菌群文章进行了细致解读，并且逐节给出Tips以便大家更容易理解核心点。

PS：文末给出了提升文章分数的几点建议。

甲状腺癌（Thyroid Carcinoma，TC）TC是目前女性第五位最常见的恶性肿瘤。越来越多的研究表明，肠道菌群的组成和代谢可能是胃肠道和肠道外肿瘤发病的重要环境因素。然而，TC患者的肠道菌群组成信息却知之甚少。

发表期刊：International Journal of Cancer

影响因子：4.982

研究内容：肠道菌群、代谢谱与甲状腺癌之间的关系

样本数量与类型：16S测序：30 Thyroid Carcinoma(TC) vs 35 Healthy Controls(HCs) ; 代谢组：15 Thyroid Carcinoma(TC) vs 15 HCs；样本类型：粪便样本；

实验方法：16S rRNA基因测序+非靶向LC-MS代谢组检测

实验设计：

纳入标准：

• 18-65岁，甲状腺超声检查至少发现一处实性病变
• 从健康筛查中心招募50名年龄、体重指数（BMI）和性别匹配的HCs；
• 根据超声检查和甲状腺功能临床指标，HCs无甲状腺损害。

排除标准：

• 怀孕、泌乳、吸烟、酒精成瘾、高血压、糖尿病、体重指数< 18.5或> 27、最近(< 3个月)使用抗生素、益生菌、益生元、共生、激素药物、泻药、质子泵抑制剂、胰岛素增敏剂或中药；自身免疫性疾病史，如自身免疫性甲状腺疾病、多发性硬化(MS)、类风湿关节炎、肠易激综合征(IBS)或炎症性肠病(IBD);有恶性肿瘤或消化道手术史(如胃切除、减肥手术、结肠切除、回肠切除、胆囊切除或阑尾切除)。

样本采集：

• 所有受试者在禁食一晚（≥ 8 h）后于早晨接受检查。所有受试者的外周血（15 mL）和粪便样本同时采集。

Tips：严格的受试者筛选、规范的样本采集与保存，将帮助你获取可靠的实验结果。如需要，可联系我们索取样本采集指南。

研究发现

1.     研究人群和临床指标

为研究TC患者的肠道菌群和代谢产物，使用16S rRNA基因测序分析了74份粪便样本，9名受试者因测序时reads较低或离散点而从后续分析中排除。最终，65例受试者（n = 30 和n = 35，TC vs. HC）进行下一步统计分析。此外，从74例患者中随机选择30份粪便样本进行非靶向代谢组学分析 (UPLC-Q-TOF/MS)。所有研究对象 (n = 74) 均为汉族，出生在中国东北，饮食结构相似（编者注：建议将地区与饮食差异对肠道菌群的差异考虑在内）。除载脂蛋白 B (ApoB) 外，各组临床指标差异均无统计学意义 (p = 0.047)。TC患者和HCs的统计学和临床特征见表1。

Tips：本研究中约10%的纳入样本或因为测序数据量低，或因为数据出现离散而被舍弃（属于不可控因素）。因此，建议招募人员和采集的样本数量应比实际检测的样本数量多1~2倍，实验检测的样本数量也应该比设计的数量多检测一些，留出样本淘汰的余量。

表1 TC患者和HCs的临床和统计学特征

2.     TC患者和HCs肠道菌群分析

Big Tips：本章节是代表性的肠道菌群检测结果呈现，非常全面。从肠道菌群多样性分析 → 差异菌属鉴定 → 与临床指标相关性分析以及预测疾病能力评估 → 菌群基因功能预测。联川医学16S测序项目分析结果完全匹配上述研究逻辑，并全面覆盖下述结果图表，最新升级至权威的QIIME 2分析流程进一步提升结果的准确性和图表的新颖性。（发微生物组16S测序高分文章，四招让你事半功倍 | 微生物专题）

2.1  TC患者和HCs肠道菌群分析

为评估两组间细菌多样性的差异，进行TC组和HC组的α多样性和β多样性分析。

通过绘制丰富度稀疏曲线（Sobs指数）评估测序深度，各组曲线接近饱和，说明测序深度足够（1a）。Chao1指数显示TC组具有更高的物种丰富度（1b），而Shannon指数也是TC组更高，也表明其具有更高的多样性（1c）。

通过两个组门水平的菌群组成分析，观察到TC组患者的厚壁菌门（Firmicutes）和变形菌门（Proteobacteria）比例增加，而拟杆菌门（Bacteroidetes）比例降低（1d）。TC患者的菌群组成在科和属水平上也发生了变化（见辅助材料）。TC组F/B比值明显高于HCs组（1e）。基于Spearman相关性分析证实F/B比值、年龄和BMI之间具有相关性，但所有受试者之间没有显著相关性（1f）。

为评估菌群之间的相似程度，使用Bray-Curtis方法计算β多样性值，并进行PCoA分析，结果表明TC组个体与HCs个体存在显著差异（1g，1h）。

图1 TC患者和HCs肠道菌群组成的多样性增加和偏移

Tips：菌群数据的描述都会从菌群的α多样性、β多样性、菌群结构组成等入手，并着重介绍不同组样本各自的菌群特征。属于联川医学菌群16S测序项目的常规分析结果。

2.2  TC患者肠道菌群与HCs不同

为确定与TC相关的特异菌群，使用LEfSe分析比较TC患者和HCs肠道菌群组成。LEfSe分析显示在门（n=3）、科（n=11）和属（n=31）水平上有45个差异菌（LDA>3，p<0.05，图a）。也采用Mann–Whitney U检验不同分类水平上的肠道菌群变化，在p< 0.05时鉴定出45个不同的丰富菌群（b），在Q值<0.05时鉴定出41个不同的丰富菌群（c）。上述两种分析方法的结果几乎一致。

将这些不同的菌属构建一个相互作用的网络来描述TC相关肠道菌群标志物之间的相关性。TC中富集的菌属比HC富集的菌属之间的相互联系更紧密。TC富集的Blautia与 HC中减少的Prevotella_9呈负相关，HC中减少的拟杆菌属与乳球菌属、[Eubacte-rium]_hallii_group以及Coprococcus_3呈负相关（2d）。TC富集菌属和HC富集菌属的相互作用网络分别如图 2e和2f所示。肠道菌群通过通讯维持动态平衡；因此，研究不同菌属之间的相互作用可以了解这些物种在TC发生中的重要作用。

图2 TC患者肠道菌群在门和属水平的种系变化

Tips：本节重点介绍TC患者不同于HCs的肠道菌群特征。使用主流的LEfSe分析鉴定出TC组与HC组在不同分类层级上的菌属差异（biomarker），并通过相互作用网络来图形化展示。属于联川医学菌群16S测序项目的常规分析结果。

 2.3  肠道菌群物种与临床指标的关系

为探讨TC中肠道菌群的预防与鉴别能力，用Spearman相关性分析研究了不同菌属的相对丰度（n=31）和临床指标（n=32）之间的多个协变量（3a）。

TC富集的菌属丰度水平，包括乳球菌属（Lactococcus），Ruminococcaceae_UCG_002，Intestinibacter，Clostridium_sensu_stricto_1，Christensenellaceae_R-7_group，Lachnospiraceae_ND3007和Turicibacter与脂蛋白a（Lpa）滴度正相关。TC富集的菌属丰度，包括Ruminococcaceae_UCG-014和Lactococcus与载脂蛋白B（ApoB）水平负相关。然而，ApoB水平与一些HC富集的菌属是正相关的。其他临床指标也与不同的菌属正相关或是负相关（3a）。

图3a 使用Spearman相关分析评估32个临床指标和31个差异菌属之间的关系

为探索肠道菌群对TC状态的预测能力，基于LDA值选择前10个菌属作为候选，最后选出6个菌属并构建最佳预测模型。这个模型具有稳定且具有统计学意义的诊断准确性，AUC = 0.94 (95% CI, 0.83-1.00)（3b-c）。根据TC预测的生物标志物丰度绘制热图，显示TC组与对照组之间有明显的分离（3d）。这表明使用肠道菌群分类器可以从HCs中区分出TC患者。

图3b-c 基于6个菌属构建最佳TC预测模型

图3d 热图分析6个标志物在TC组和HC组的相对丰度

Tips：分析菌群与各种临床指标的相关性，以及寻找潜在的菌群标志物，是临床菌群研究的重点内容，具有重要的临床应用价值。当你确定候选的菌属，并提供临床指标数据，我们会为你分析菌属与临床指标的相关性，并计算AUC值来评估菌属预测模型的准确性。

2.4  TC患者肠道菌群功能变化

为描述TC患者肠道菌群的功能改变，使用PICRUSt分析16S rRNA基因测序数据预测具有的功能。在测试的236条KEGG（level 3）路径中，TC患者组和HC组之间有45条通路差异富集（p<0.05），其中12条通路Q值<0.05（3e），例如醚脂代谢、脂肪细胞因子信号通路等。接着使用Spearman相关分析研究不同物种（n=31）的相对丰度与不同KEGG通路（n=45）之间的相关性，并生成相关性网络图（见辅助材料）。

图3e 45条差异KEGG通路被分为6类

Tips：预测肠道菌群的基因功能，将帮助你解释肠道菌群影响宿主的可能途径，是初步关联菌群与疾病关系的重要一环。我们会使用最新版的PICRUSt 2为你开展更丰富的菌群基因功能预测。

通过上述分析，发现肠道菌群丰度与一些血脂水平（如LPa，ApoA，ApoB）以及脂质相关的代谢途径（如-α亚油酸代谢和醚脂代谢）相关。由此推测肠道菌群失调与TC发育相关，并且脂质代谢失调可能是一个调节因素。作者接着对15例TC患者和15例HCs的粪便样本进行非靶向代谢组（LC-MS）分析。

首先使用Venn图从OTU数量和类别、差异菌属和差异通路角度确认缩小的样本量（n = 15 each group, TC vs HC）仍可以代表上述肠道菌群的总体情况（4a-c）。在15例HCs和15例TC患者之间有28个显著差异菌属 (4d) 和39个差异KEGG（level 3）通路 (4f) 。基于LDA 值选出前10个菌属作为候选的细菌标志物，并进行ROC和RF分析。最终预测模型纳入8个菌属，AUC为0.96（95% CI，0.84-1.00，4e）。28个显著差异菌属与32个临床指标的 Spearman 相关分析显示，ApoB水平与TC富集菌属Butyricicoccus呈正相关，而与HC富集菌属Megamonas和Faecalibacterium呈负相关。临床指标LPa与TC富集菌属（如Blautia, Dorea和Intestinibacter）正相关，与HC富集的 Ruminococcus_gnavus_group和Lachnospiraceae_NK4A136_group负相关。此外，28个差异菌属与39个差异KEGG通路之间的Spearman相关分析显示，许多差异菌属与差异KEGG通路显著相关，如TC富集的Blautia属，其与细胞凋亡、醚脂代谢信号通路等呈正相关（4g）。HC富集的拟杆菌属与许多途径（如细胞凋亡、醚脂代谢等）呈负相关，与许多其他途径（如聚糖生物合成和代谢等）呈正相关（4g）

图4 15例TC患者和15例HC的肠道菌群组成和功能特征

Tips：无特殊情况，代谢组与16S检测的样本对象和数量应保持一致。如果本实验代谢组检测对象和样本数量与16S保持一致，则无需进行图4的分析。

3. TC患者和HCs的代谢谱

Big Tips：肠道菌群通过其代谢物影响宿主（如疾病发生）是其与宿主互作的主要途径之一。肠道菌群16S数据和代谢组的关联分析已成为肠道菌群研究的主流模式。本章节是代表性的粪便代谢组与肠道菌群关联分析的结果呈现。从粪便代谢物鉴定及预测能力评估 → 差异菌属与代谢物相关性分析 → 关键代谢物的代谢途径分析。拓展阅读《客户文章：16S+代谢组炼就8分肠道菌群文章 | 微生物专题》

3.1  模式识别分析与代谢物鉴定

LC-MS共观察到2071个可检测峰（n = 15 per group, TC vs. HC）。数据用于多变量统计分析。

基于PCA分析，TC患者显著区别于HCs（5a）；基于PLS-DA分析，TC患者和HCs根据其代谢物差异可以分为不同的组群（5b）。

TC组共鉴定出72种代谢产物（VIP>1.0，p<0.05）。热图显示，72种代谢物主要分为22种甘油脂类、12种甘油磷脂、4种鞘脂、6种甾体及甾体衍生物、3种丙烯醇脂类、3种苯类、5种黄酮类、2种氨基酸、3种脂肪酸和12种其他分类代谢物。这些代谢物中的大部分在TC患者中显示出较高的浓度（5d）。

作者也关注到一些代谢产物，如游离脂肪酸（硬脂酸（VIP>1.0，p>0.05））和胺（组胺（VIP>1.0，p>0.05）），它们在TC患者体内的浓度高于HCs（5e）。此外，胆汁酸（牛磺去氧胆酸）和中链脂肪酸（MCFAs）、己酸和癸酸（VIP<1.0）在TC患者中的浓度较低（5e）。

图5 TC患者的异常代谢模式

探讨了粪便代谢物对TC患者和HCs的鉴别能力。确定了5种代谢物，并构建了AUC值最高的最佳性能预测模型（AUC=0.91；95%CI，0.76–1.00）（6a-b）。

图6(a-b) 5种代谢物预测模型

Tips：从整体描述TC组与HC组的代谢谱入手，重点介绍两组间显著差异表达的代谢物，并检验代谢物预测疾病的能力。属于联川临床代谢组检测项目的常规分析结果。

3.2  差异菌属与代谢物的关系

为进一步研究肠道代谢产物丰度的改变是否与差异肠道菌群相关，采用Spearman相关分析确定出28种菌属和72种代谢产物（表2）之间的协变关系, 并绘制相关性网络来做阐明（6d）。

表2 部分显著差异代谢物信息（VIP>1，p<0.05）

图6d 利用共生网络分析了72种差异代谢物和28种差异菌属之间的相关性

72种差异代谢物和21种共有的差异肠道菌属展示在热图上（6e）。与前述结果类似，一些TC富集的菌属（如Klebsiella, Coprococcus_3和[Eubacterium]_hallii_group）与脂质相关代谢物相关。此外，Lactobacillus，Blautia，Megamonas和Erysipelotrichaceae_UCG-003与氨基酸、类黄酮和苯相关代谢物相关。

图6e 热图显示差异代谢物和差异菌属的相关性

为探索肠道菌群结合代谢物辨别TC状态的潜在能力，根据前述方法利用所有标志物构建了一个最佳预测模型。最后，与8种肠道菌属 (AUC = 0.96) 和5种代谢产物 (AUC = 0.91) 相比，基于8种不同菌属加5种不同代谢物能更准确地鉴定出TC，AUC高达0.97（95%CI, 0.86–1.00）（6c）。

图6c 不同标志物的预测能力

Tips：采用Spearman算法重点分析两组间差异菌属和差异代谢产物的相关性，并分别评估差异代谢物以及菌属+代谢物预测疾病的能力，找到最佳预测模型。本节分析属于联川医学肠道菌群与代谢组关联分析内容之一，当你确定候选的菌属和代谢物，我们会为你进行两者的关联分析，以及标志物预测能力的评估。

3.3  粪便关键差异代谢产物的代谢途径分析

使用MetPA数据库和KEGG数据库，分析TC患者和HCs之间差异代谢物参与的通路（6f）。对TC起响应的主要通路是癌症（癌症和胰腺癌的胆碱代谢）、细胞生长和死亡（坏死性凋亡）、脂质代谢（不饱和脂肪酸的生物合成、甘油脂代谢等）、免疫系统（Fc-gamma R介导的吞噬作用）等。与PICRUSt功能预测的通路一致，TC患者的脂肪细胞因子信号通路、鞘脂代谢、胆固醇代谢和坏死性凋亡通路也显著富集。因此，肠道代谢物的变化可能将肠道微生态失调与TC的进展和维持联系起来。

图6f 72种差异代谢物的通路富集

Tips：通过差异代谢物的Pathway分析，会帮助你将肠道菌群失调与肿瘤的关系串联起来，回答肠道菌群影响肿瘤进展和维持的可能机制。属于联川医学代谢组检测项目的常规分析结果。

编者说本研究采用目前主流的肠道菌群与疾病关系的研究策略，联合肠道菌群16S测序和粪便代谢组（极具性价比的检测组合），并结合临床指标来一起讨论，给出甲状腺癌患者的肠道菌群特征和代谢谱，潜在的疾病标志物，以及肠道菌群影响肿瘤发生发展的潜在途径，可作为新手开展肠道菌群研究的范例。本研究也存在一些局限，如能对下述实验过程做改善，将能更深入地探究肠道菌群与甲状腺癌的关系，提升文章分数：1. 本研究是单中心横断面研究，只考察了少量样本，特别是代谢组检测（n = 15 per group）；临床菌群研究，除非样本难以获取，建议微生物组与代谢组检测样本数量都≥50例/组；同时如能考察菌群的连续周期变化以及多中心收集样本将能得到更具说服力的证据；2. 尽管本研究鉴定出肠道菌群、代谢产物和临床指标之间的复杂关系，但并没有提供潜在的更全面信息。即仅讨论了肠道菌群变化与疾病的相关性，而未讨论因果性；3. 采用16S测序虽能分析肠道菌群多样性并预测基因功能，但与真实情况仍存在明显的差异。如再加上宏基因组测序，宏转录组测序将能更准确地揭示菌群组成、注释基因功能，以及深入揭示菌群影响宿主的可能机制。

参考文献

Feng J, et al. Alterations in the gut microbiota and metabolite profiles of thyroid carcinoma patients. International Journal of Cancer 2019, 144: 2728-2745.

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