跨物种单细胞分析胰腺导管癌

文章信息

今天介绍的文章于2019年6月13号发表在CANCER DISCOVERY，文章题目是：Cross-Species Single-Cell Analysis of Pancreatic Ductal Adenocarcinoma Reveals Antigen-Presenting Cancer-Associated Fibroblasts

  摘要  

癌症相关成纤维细胞（Cancer-associated fi broblasts， CAF）在胰腺导管癌Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC)进展和抗药性中发挥重要作用。CAFs组成一个多样化的细胞群，本研究用单细胞RNAseq测序全面描述人类和小鼠PDAC肿瘤微环境特点。不仅验证了存在肌纤维母细胞（myofibroblastic）和炎症（inflammatory）两种CAFs，而且进一步描述了一种新型CAFs，表达II类MHC和CD74，定义这种细胞群为“抗原呈递（antigen-presenting）CAFs”。

 背景   

PDAC致死没有治疗方案。PDAC特点是有很多基底细胞支持癌细胞的增殖、存活和侵袭。这些细胞中，CAF在促进癌症生长的过程中起重要作用。但结果表明CAF并非唯一促进细胞的因素。一种解释就是CAF是由不同功能的亚群组成。

本研究用6个PDAC病人的癌组织和其中2个病人的正常癌旁组织，4个PDAC Kras+/LSL-G12D; Trp53+/LSL-R172H; Pdx1-Cre (KPC)小鼠组织。鉴定了PDAC的不同亚群，证实了不同myCAF和iCAF亚群的存在，还鉴定了一个新的CAF亚型。

 单细胞分析揭示PDAC复杂性   

6个未治疗的PDAC患者肿瘤组织和其中2个患者的邻近正常胰腺组织，总共21,200个细胞（A）。识别出高度可变的基因后，使用t-SNE将数据集嵌入到二维空间中。Density-based clustering鉴定了15类（B），每类平均有5246个转录本和1576个基因。细胞分类中，大部分为免疫细胞（89%），成纤维细胞只占1.75%，此外还有胰腺腺泡细胞和导管细胞。每类的标记基因与文献中已知marker对照（C），相互验证。

 不同细胞群亚类   

PDAC中导管细胞分离后单独聚类：分成4个亚类，其中3类在癌和正常组织中都有，1类只存在于癌旁正常组织。

PDAC免疫细胞单独分析：无监督降维和聚类，将骨髓细胞（cluster 3）与T和NK细胞（cluster 4）分别在癌组织和癌旁正常组织中进行分类。CD4+ T细胞(subcluster2)和regulatory T cells (Treg)主要来自癌症样本。

抗体富集成纤维细胞，对962个成纤维细胞，进行t-SNE分析：分成2个具有独特基因特征的亚类。与前期ICAF和myCAF亚类一致，亚类1中白细胞介素高表达，亚类2 αSMA基因高表达量，分别鉴定为iCAF和myCAF。癌细胞和正常细胞中大部分是iCAFs。研究发现了一些新的分类marker。GSEA分析2个亚群的差异表达基因。利用enriched regulon analysis (VIPER)算法计算蛋白活性，验证2个亚群的不同pathway和鉴定调控蛋白。

 小鼠KPC肿瘤   

4个KPC小鼠PDAC模型，11,260个细胞，每个细胞5,989 个转录本，1,916个基因。分成12类，中位数为6,720转录本和2,048个基因。KPC肿瘤中成纤维细胞的分析发现了一个新的有抗原呈递特征的CAF亚型成纤维细胞富集群。包括8,443个细胞，分成了10类细胞类型，包括EPCAM-negative导管细胞和成纤维细胞。

单独研究成纤维细胞群，t-SNE分成3类，其中两类与人类iCAF（炎症介质）和myCAF（平滑肌基因）特征相似，2类截然不同，表达MHC Ⅱ类基因，常在免疫系统的抗原呈递细胞APC（antigen-presenting cells）中表达，所以命名为“antigen-presenting CAFs” (apCAF)。

为了检测3个CAF亚群的调控因子，用ARACNe和VIPER算法进行蛋白活性分析。apCAFs中高度活跃的蛋白是MHCⅡ类相关基因H2-Ab1和Cd74。用IHC验证pan-CAF marker PDPN蛋白在CAFs中的表达。用RNA ISH在小鼠KPC中验证了MHCⅡ基因的表达。

流式细胞仪分离CAF亚型：利用anti-Ly6C和anti-MHCII 抗体,PDPN-positive可将细胞分成3类。(i) Ly6Cpositive,(ii) MHCII-positive, and (iii) MHCII/Ly6C-double negative,分别对应iCAFs,apCAFs, and myCAFs。qPCR也提供了验证。根据基因表达，猜测apCAFs是从EMT癌细胞中产生。

 人类PDAC中apCAFs是否存在？  

从小鼠中检测到之后，想在人类中寻找有无apCAFs。筛选HLA高表达的CAFs，同时表达apCAFs marker CD74，人中有20.9%。这些主要在iCAF中，但并未单独聚成类。

人CAFs中的VIPER调控分析表明主要调控因子CD74和XBP1在iCAFs中活跃程度不同，支持了人类PDAC中存在apCAF的观点。为证明apCAFs在PDAC中存在，RNA IDH检验成纤维细胞marker COL1A1和CD74，鉴定了两个转录本的存在。IHC染色，成纤维细胞marker PDGFRβ和MHCII进一步证明apCAFs在PDAC中的存在。最后，用IMC和抗体进一步证明。

apCAFs动态特征：

之前证明myCAF和iCAF代表了可逆转的细胞状态。KPC剥离的apCADs和2D培养apCAFs进行表达量比较，发现丢掉了一些MHCⅡ表达和其他一些marker。表明一个动态的成纤维细胞群。

apCAFs可以给T细胞呈递抗原：

apCAFs呈递MHCⅡ分子说明该亚型与CD4+ T细胞的相互作用。KPC肿瘤移植到胰腺MHCⅡ-EGFR敲入的小鼠，让其长PDAC。证明存在三种亚型。对移植后的APCs排序，看是否可以呈递抗原，apCAFs可以呈递抗原，而myCAFs和iCAFs不能。经检验，apCAFs表达MHCⅡ，不表达共刺激分子。

 小结：PDAC中的CAF亚群及特点  

成纤维细胞分析综合评估了前期发现的iCAF和myCAF亚群的转录组，并为这些细胞提供了新的标记基因。该工作还发现了一个新的CAF亚群，apCAFs，它表达MHCII分子，并可向CD4+ T细胞呈递抗原。

 意义   

胰腺导管癌中成纤维细胞的异质性对于针对性治疗促进癌症发生的CAFs有重要作用。该研究鉴定了表达II类MHC的CAFs，可以呈递抗原给CD4+ T细胞，从而调控胰腺癌的免疫反应。

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