深度PE250扩增子测序揭示益生菌是如何塑造仔鱼的肠道菌群 | 微生物专题

肠道是消化系统的重要组成部分，是生物体不可缺少的代谢器官，微生物可以通过竞争成功地在肠道中定植并附着在其表面。肠道微生物群落的平衡对宿主的健康有重要的有益影响。在水产养殖业，细菌性病害是比较严重的问题之一，而解淀粉样芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)被认为是一种潜在的可用于水产养殖的益生菌，因为它可以保护水生动物免受多种菌体的侵害。本研究中，课题组在大菱鲆（Scophthalmus maximus）仔鱼摄食时引入B. amyloliquefaciens，采用高数据量的HiSeq PE250扩增子测序深度分析鱼肠道内的微生物群落因此发生的变化，探讨B. amyloliquefaciens作为益生菌对鱼肠道内微生物群落结构的影响[1]。

实验设计实验组和对照组被随机分配到两个池塘，每个池塘加入相同数量的个体仔鱼。在孵化后的第3 ~ 27天，实验组仔鱼以添加了B. amyloliquefaciens益生菌的活性饲料喂养，对照组仔鱼以未添加益生菌的饲料喂养。其中，第3-13天以Branchionus plicatilis（褶皱臂尾轮虫）为食，第10-27天以Artemia sinica（卤虫）为食，16天后逐渐改为丸形饲料。饲料的改变和量的添加是根据生长时期逐渐变化的。


测序方案扩增区域：V3+V4；测序平台：Illumina PE250扩展阅读：从illumina测序仪进化史中，找到更优秀的微生物组测序工具 | 微生物专题

实验结果实验组肠道内微生物种类的丰富度和菌群多样性均低于对照组。在整个发育过程中，肠道菌群结构在第一次饲喂前就已构建，并且优势OTUs组成稳定，OTU8、OTU124、OTU150、OTU107和OTU17的丰度始终较高。与对照组相比，实验组仔鱼在发育和生长的不同时期，肠道菌群结构相似。但是，同时期不同处理之间的菌群结构相似度很低，且共有OTU的平均比例仅为74.7％。在早期发育阶段（3-30天），实验组中Pseudomonas（假单胞菌）的平均丰度降低了0.8％，而Lactococcus（乳球菌）的平均丰度提高了3.5％。
1. 肠道样本的采集如图1所示，在整个试验期间，在下一次喂食前的上午9点采集仔鱼样本。2. 测序数据统计
样本平均有效数据为36540，长度分布主要为415-424 bp。所有样品的主长度分布的相对比例均高于60％，平均值为80.61％。3. Alpha多样性分析
利用ACE值评价微生物物种丰度。如图3所示，在不同处理下3 ~ 120天期间ACE值先升高后降低。在整个发育过程中，实验组第27天ACE值最高(557.3)，对照组第30天ACE值最高(636.4)。在第3 ~ 27天，实验组ACE值低于对照组(不包括第21天)，第13天的处理有显著差异(P < 0.05)。在仅提供颗粒饲料的第30~120天，实验组的ACE值较低于对照组（不包括第60、80和120天）。利用Shannon指数表示微生物群落的多样性。如图3所示，Shannon指数在第3 ~ 21天整体低于第27~120天。第27天对照组的Shannon指数最高(4.86)。同样，在发育阶段实验组的Shannon指数低于对照组（不包括第13、30和40天）。实验组和对照组Shannon指数只在第120天有显着差异（P <0.05）。由此表明，添加B. amyloliquefaciens可以减少大菱鲆肠道内微生物种类的丰富度和微生物群落的多样性，并且这种效应可能在其以后的发育阶段中持续存在。4. 微生物组成分析基于OTU水平，图4显示了不同处理条件下大菱鲆仔鱼肠道中的菌群结构。根据主成分分析，PC1，PC2和PC3是三个主要的主成分，其中PC1，PC2和PC3分别表示了37.9％，14.4％和9.3％的变异。两点之间的距离表示微生物群落结构的相似性，其中每个点代表一个样品。分析发现，对照组中样本的分布是高度分散的，且其余大部分时间的样本和第0天及第2天的样本分布都较远。相比之下，实验组中所有样本分布得都非常接近，且实验组中样品之间的距离和第0天及第2天相对较小。由此表明，添加B. amyloliquefaciens改变了大菱鲆仔鱼肠道菌群的组成，有助于稳定和均质化微生物群落。这种对微生物区系结构的影响也可能在大菱鲆仔鱼发育后期持续存在。以大菱鲆仔鱼生长发育过程中的OTUs为基础，分析了两组的肠道微生物群落的相似性。如图5所示，实验组OTU数量变化与对照组相似。实验组OTU数量在第3~13天和第60~80天低于对照组，在第27~40天和第100~120天高于对照组，在第21天和第50天持平。此外，两组之间第3~40天的OTU数量差异大于后期。实验组OTUs在第30天最高(185)。两组中普通OTU的比例均呈先上升后下降的趋势。比例最高(84.5%)发生在第7天，最低(59.9%)发生在第40天。在整个发育期，两种处理中的普通OTU平均比例为74.7%。由此可见，添加B. amyloliquefaciens会影响大菱鲆仔鱼的OTUs总数和普通OTUs的比例。5. 优势菌群的变化
如图6所示，展示了每个样本中占优势的前10个OTUs，除第0天外，所有样本的OTUs都是基于5次重复的平均值。在第0~2天第一次喂食前，大菱鲆仔鱼的肠道内是有微生物群落存在的。在第0~40天，各处理间菌群结构相似，其中OTU8丰度最高，其他主要的OTUs包括OTU124、OTU150、OTU107, OTU17。除第27天外，每个样本中这些主要OTUs的相对丰度之和大于0.53。在第50~120天，OTU289的相对丰度增加，取代OTU8成为最丰富的OTU。另外，OTU289、OTU8、OTU74、OTU124、OTU150、OTU107、OTU17占主导地位，各样本中这些OTUs的总和均大于0.60。因此得出，OTU8、OTU150、OTU124、OTU17、OTU107始终是大菱鲆仔鱼肠道内的优势OTUs，并贯穿整个发育期。此外，优势OTU的类型和相对丰度的相似性也表明了大菱鲆仔鱼在整个发育期间主要微生物体系的组成均相似。在发育早期和后期相比，OTU289和OTU74的丰度变化特别明显，且虽然OTU8的相对丰度有所下降，但始终处于优势地位。这三种主要OTU的相对丰度的变化在不同处理中是不同的，在第3~30天，实验组的OTU8丰度始终高于对照组，但在第40~120天则相反。与对照组相比，实验组在第40~120天的时候OTU289相对丰度较高，在第50~120天时，OTU74丰度增加并占优势，但实验组的OTU74丰度低于对照组。由此可见，在提供活性饲料阶段，将B. amyloliquefaciens引入饲料中会影响大菱鲆仔鱼肠道中主要微生物体系的结构。但是，在使用颗粒饲料和不添加解淀粉芽孢杆菌的阶段，对肠道内主要微生物成份的影响更为明显。这些结果表明，解淀粉芽孢杆菌对大菱鲆仔鱼肠道菌群主要结构的影响在发育后期。图6所示的OTUs的标注信息见表1。在门水平上，这些OTUs大部分属于Firmicutes（厚壁菌门）和Proteobacteria（变形菌门），其中Bacilli（杆菌纲）和Gammaproteobacteria（变形菌纲）是主要的类群。在属水平上，Lactococcus（乳球菌属）、Arthrobacter（节杆菌属）、Solibacillus（土壤芽胞杆菌属）和Pseudomonas（假单胞菌属）为主要菌属。含量较高的OTU8和OTU107属于Lactococcus，OTU289为Vibrionaceae（弧菌科），OTU122和OTU996属于 Pseudomonas。
另外，如图7所示，比较了所有属于Lactococcus和Pseudomonas的OTUs的相对丰度。除第13天外，实验组的Lactococcus spp.丰度均高于对照组，在第3~30天为0.4%-6.6%，平均值为3.5%，而在第40~120天丰度较低。但实验组的Pseudomonas spp.丰度较对照组低，在第3-30天为0.08%~1.9%(均值为0.8%)，而在第40 ~ 120天实验组的丰度较高。其中，第21天和第60天的差异显著(P < 0.05)。由此可见，在第3~30天内，在活性饲料中引入B. amyloliquefaciens会降低早期Pseudomonas的丰度，增加了Lactococcus的丰度，但这种作用在后期发育阶段没有持续发生。

讨论在大菱鲆仔鱼的整个发育周期，由于分阶段的喂食方式和种类的变化，可能是造成后续数据分析中的某些特异性现象，如实验组在3~30天的早期阶段Lactococcus的相对丰度较高，而在第13天则没有，可能是由于在第10天的时候饲料由以B. plicatilis更改为A. sinica，从而导致了微生物群落的差异。已有研究表明，在门水平上，Firmicutes、Proteobacteria和Bacteroidetes（拟杆菌门）是多种鱼类的优势菌群[2-3]。本研究也得到了相同结果，在大菱鲆仔鱼肠道微生物群落中以Firmicutes和Proteobacteria为主，共占60% (图4和表1)。本研究探讨了B. amyloliquefaciens的使用有利于优化大菱鲆仔鱼肠道内的微生物群落结构，这也同样可以解释B. amyloliquefaciens的益生菌作用。本研究为大菱鲆养殖过程中肠道菌群结构的生物调控提供了理论依据。参考文献：[1] Jiang Y, Wang Y, Zhang Z, Liao M, Li B, Rong X, et al. (2019) Responses of microbial community structure in turbot (Scophthalmus maximus) larval intestine to the regulation of probiotic introduced through live feed. PLoS ONE14(5): e0216590. https://doi.org/10.1371/journal. pone.0216590[2] Rimoldi S, Gliozheni E, Ascione C, Gini E, Terova G. Effect of a specific composition of short- and medium-chain fatty acid 1-Monoglycerides on growth performances and gut microbiota of gilthead sea bream (Sparus aurata). PeerJ, 2018; 6: e5355. https://doi.org/10.7717/peerj.5355 PMID: 30083467[3] Jiang Y, Liu Z, Liu X, Xu Y, Shi B, Wang B. Structural characteristics and succession of intestinal microbiota for Paralichthys olivaceus during the early life stage. Aquaculture Research; 2019, 50: 529–540.https://doi.org/doi:10.1111/are.13924
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