跨学科研究：从肠道菌群评估纳米材料的安全性 | 微生物专题

前沿热门的材料物理学与科研新贵肠道微生物会摩擦出怎样的火花？《自然》杂志说：“人们越来越认识到,物理学的思维形式将对生物学在后基因时代成果的取得起至关重要作用”事实上，随着遗传学对从人类健康到农业生产等诸多领域产生推动作用开始，全世界的物理学家和数学家们就纷纷地投身到生命科学领域中来。

文章名称：口服二氧化钛纳米颗粒对肠道菌群和肠道相关代谢的影响发表期刊：Nanoscale影响因子：6.970发表时间：2019研究方法：肠道微生物组16S测序和非靶向代谢组检测

背景介绍

氧化钛纳米颗粒为一种大小在100 nm以下的白色疏松粉末。它具有抗紫外线、抗菌、自洁净、抗老化性能。纳米氧化钛具有十分宝贵的光学性质，在汽车工业及诸多领域都显示出美好的发展前景。尤其是氧化钛纳米颗粒在食品包装上的应用备受瞩目。但当随之而来的是其作为食品包装的安全问题。本实验便是应用肠道微生物和代谢组学的方法，研究因口服氧化钛纳米颗粒而产生毒性的间接途径的定量定性分析。

材料选择

1.大小为29±9nm的氧化钛纳米颗粒。

2.三周大的健康大鼠，使用商业颗粒饲料与去离子水饲养。温度20±2摄氏度，昼夜12+12。

如图A所示，电子显微镜测量的氧化钛纳米颗粒平均尺寸为29±9 nm。且EDX结合电镜结果可以看出Ti原子与氧原子的比例为1：2.为了表征氧化钛纳米颗粒在暴露介质与小鼠肠道中的特性，分别在超纯水(H₂O)、人工胃液(AGJ)和人工肠液(AIJ)中的水动力计和zeta电位进行了测定。

实验方法

1.   将TiO₂NPs分散在超纯水中，处理15分钟。（为了获得均匀的悬浮，在每次使用前对颗粒悬浮液进行涡流搅拌处理）。

2.   悬浮液TiO₂NPs(每公斤水 0、2、10、50 mg)灌胃给药，每日1 mL，连续30天。（根据美国10岁以下儿童口服TiO₂NPs的基础上，选择大鼠灌胃TiO₂NPs的剂量。）

3.   在整个暴露期间，每天观察并记录症状和死亡率，直至30天。每7天测定大鼠体重，每3-4天记录大鼠进食情况。在实验过程中，大鼠的体重和食物摄食未见明显变化，也未观察到死亡。

4.   在第7、14和28天收集大鼠粪便，于-80 ℃冰箱中快速转移储存。

5.   30天后，动物被称重并被宰杀。血液样本取自腹主动脉。取血清，3000 rpm (1500g)离心10分钟，取结肠组织，部分匀浆。

6.   将收集到的粪便样本分别进行16S测序和非靶向代谢组检测。部分结肠组织显微观察并记录。 

主要结果

1.口服氧化钛纳米颗粒会对大鼠结肠造成一定程度的损伤。

2.口服氧化钛纳米颗粒7天后，菌群未见明显变化。到第14天，获得了3个差异表达的菌株（LDA得分> 4）到第 28 天，获得了 2 个差异表达的菌株（LDA 得分> 4）。

3.口服组与对照组相比，N-乙酰组胺，己内酰胺，甘油磷酸胆碱，维生素B6， 2,3,5,6-四甲基吡嗪，色胺，胞嘧啶，腺苷和 D-哌啉酸显著增加。包括 4-甲基-5-噻唑乙醇，L-组氨酸，L-鸟氨酸等 16 种代谢物显著减少。

4.出现了脂多糖的变化。脂多糖的增加应该是肠道菌群变化的结果。而粪便中的6种短链脂肪酸则没有差异。

5.口服TiO₂NP持续30天。与对照组相比，TiO₂NPs暴露后大鼠的MDA含量增加，SOD活性降低。TiO₂NPs引起脂质过氧化（MDA）积累和抗氧化酶（SOD）活性降低，表明氧化还原平衡被破坏。同时，我们通过量化血清中炎症细胞因子的浓度来评估大鼠的炎症状态。我们观察到口服50 mg. kg−1TiO₂NPs 30天的大鼠血清中IL-6的浓度增加。氧化应激生物标志物和炎症细胞因子的变化表明，氧化应激状态和炎症反应是通过口服TiO₂NPs诱导的。

（提示：本文得出的口服TiO₂NPs所造成的伤害均是间接损伤，而直接损伤是指由口服TiO₂NPs的积累而对肝脏、肾脏、心脏、生殖系统等造成的组织损伤。但是身体对TiO₂NPs的吸收率很低，大部分都会随粪便排出体外。已有实验证明在较低剂量下“口服200mg·kg-130天 ”时，未出现肝脏肾脏中Ti离子的含量出现变化。故本实验所产生的毒性均可视作间接途径下的毒性反应。）

主要图片

图中所示为口服TiO2纳米颗粒对大鼠结肠形态的影响。

(B)和(C)为光镜下HE染色的病理表达图像(放大200x)。病理切片HE染色显示环状细胞数量减少，炎性细胞浸入结肠上皮。

(D)和(E)为结肠组织的代表性TEM图像(放大倍数:8000x)。透射电镜观察发现，50 mg / kg  氧化钛纳米颗粒处理组结肠上皮，其中大部分线粒体(绿色箭头)中嵴明显固缩和溶解。TiO₂NP处理组结肠上皮微绒毛(红色箭头)明显增多。

上图表示的是TiO₂纳米颗粒口服给药7、14、28天后对肠道菌群的影响。图中选取了细菌在门(A)、纲(B)、目(C)、科(D)、属(E)、种(F)的相对丰度前十。

此图表示的是通过组间比较的得到的alpha多样性。different groups (A) Shannon (B)、Simpson (C)、Chao1 (D)、ACE (E)和PD_Whole_Tree (F)的指标进行肠道菌群多样性的比较。Ps（我们公司的图是彩色的哦，颜值更高更有格调）

不同组间肠道菌群多样性的比较，可以根据颜色的深浅可看出处理组之间的多样性差异。

图示利用HPLC-MS非靶向代谢组学分析TiO₂纳米颗粒对粪便肠道相关代谢的影响。

代谢物浓度的热图，显示对照组和大剂量 TiO₂ NP（50 mg kg−1）治疗组30天大鼠粪便中不同代谢产物。每行代表代谢物，每列代表样品。每个网格的颜色代表相对相应样品中代谢物的浓度。（B）对照和TiO₂NP处理组样品中代谢物的PCA和（C）OPLS-DA评分图。

对照组粪便样品与TiO₂NP (50 mg* kg-1)处理组的差异代谢物及代谢途径。

(A) OPLS-DA模型代谢物火山图。x轴代表组间差异，y轴代表组间差异致信度。以p(corr) > 0.3为划界值，标有姓名标注的红点表示TiO₂NP (50mg*kg-1处理组的代谢物浓度高于对照组。名称标注的蓝点表明，TiO₂NP (50 mg*kg-1)处理组的代谢物浓度低于对照组。

(B) 对照组与TiO₂NP (50 mg*kg-1)处理组间差异代谢物的KEGG通路分析。x轴表示由out-deqree中心性算法得到的路径影响。点的大小与通路的影响有关。y轴为途径富集分析得到的p值(-log(p))的负对数。点的黄红颜色变化与对数(p)正相关。通路名称用log(p) > 1对通路影响> 0.1标记在图中。以红色方框标记的氨基酰基生物合成代谢途径在TiO₂NP (50 mg*kg-1)处理组中显著富集。

图A为不同浓度的氧化钛纳米颗粒对血浆LPS（脂多糖）的影响

图B为50mg*kg-1的处理组与未处理组的大鼠粪便SCFAs（短链接脂肪酸）含量的差异

（小贴士：微生物产生的短链脂肪酸是可以直接影响宿主的）

结论

图中所示为口服 TiO₂NPs而诱导的肠道菌群，肠道相关代谢和毒性的相互作用。

口服 TiO₂NPs 诱导毒性的机制可能是以肠道微生物群和肠道相关代谢的改变为主体来实现的。以加氏乳杆菌（L.gasseri），Turicibacter和L.NK4A136_group升高和Veillonella降低为代表的肠道菌群变化导致了肠道相关代谢的变化。在TiO₂NP暴露组中，以N-乙酰基组胺，己内酰胺，甘油磷酸胆碱为代表的代谢物增加，以4-甲基-5-噻唑乙醇，L-组氨酸和L-鸟氨酸为代表的代谢物减少。氨酰tRNA的生物合成代谢途径也发生了明显变化。口服TiO₂NPs诱导毒性的关键也是其主要的间接途径，是肠道菌群的代谢紊乱以及随后产生的 LPS导致肠道氧化应激和炎症反应。

编者说首先，不得不赞扬作者的切入点选择的非常巧妙。TiO₂NPs这一纳米材料广泛应用于我们的生产生活中，既然有作为食品包装及化妆品制作的应用，那么健康问题也必然受人关注。而作者通过肠道微生物来检验TiO₂NPs的毒性及探索代谢原理的想法很有前瞻性。这让我不得不想到上世纪六十年代的美国抗铅英雄克莱尔-帕特森。当年克莱尔为了向世界证明铅的毒性辗转十数年在地中海和大西洋的深海中取水样，还在南极洲冰层中钻了200英尺的通道，挖出的雪足足需要一百艘船才能运走。但若是克莱尔做个铅影响肠道微生物，做个代谢组，也许真相会来的更早。

参考文献

Chen Z, et al. Effects of oral exposure to titanium dioxide nanoparticles on gut microbiota and gut-associated metabolism in vivo. Nanoscale. 2019. 11(46):22398-22412.

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