其他
单细胞国自然标书模板之立项依据(综述前言) | 单细胞专题
已知乳腺癌是一种极易发生转移的恶性肿瘤之一，术后复发和化疗后极差的预后严重干扰了乳腺癌的治疗效果。因此了解乳腺癌肿瘤微环境中的免疫细胞表型对于理解癌症进展和免疫疗法反应的机制至关重要。本课题拟使用10X Genomics公司的单细胞转录组测序和VDJ免疫组测序技术，对10名以上女性患者的乳腺癌组织中的免疫细胞，以及配对的癌旁组织、正常乳房组织和淋巴结中免疫细胞进行鉴定和分析。我们还将对现有的贝叶斯单细胞生信算法进行改良，重新开发相应软件，以解决单细胞测序生信分析的难题。前期本课题已经通过Cibersort反卷积分析算法，对几十名乳腺癌患者单核细胞转录组中免疫细胞类型和mRNA表达图谱进行了初步鉴定，结果表明，尽管正常和肿瘤组织中驻留的免疫细胞之间存在显着相似性，但我们观察到了肿瘤微环境中特定免疫细胞的一些特征。后期我们打算同时结合T细胞受体（TCR）测序数据的分析揭示了不同TCR对表型多样性的影响。这些结果对于理解浸润性肿瘤如乳腺癌等免疫微环境中的免疫细胞表型和类型具有重要意义。拓展阅读：想要写好单细胞基金标书的摘要，你可能需要看：国自然单细胞项目申请 | 你的摘要够好吗？
（一）立项依据与研究内容（4000-8000字）part1. 乳腺癌简介及其研究进展或存在临床问题
part1示例：乳腺癌是继皮肤癌之后，乳腺癌是中国以及美国女性中最常见的癌症志毅。乳腺癌在男性和女性中均可发生，但在女性中更为普遍，比例高达99%。随着近些年靶向治疗、免疫治疗、新型化疗疗法以及乳房切除等疗法的改进，乳腺癌三年生存期及五年生存期已经有大幅度提高，死亡人数正在稳步下降。其中乳腺癌早筛以及新的个性化治疗方案正在起到越来越重要的作用。但是乳腺癌也存在突变进化较快，治疗后部分病人存在预后较差等情况，包括部分病人切除病灶后出现远端转移和复发等情况，其中肿瘤微环境，尤其是当中的免疫细胞起到了十分重要的作用。这对我们理解乳腺癌肿瘤微环境提出了全新的要求，以用于指导病人的早诊和干预方案的制定。 ………………Part2. 肿瘤微环境简介，肿瘤组织中驻留淋巴细胞研究简介与小结
Part2示例：肿瘤微环境不仅包括来自适应性和先天性谱系的癌细胞、正常上皮细胞和免疫细胞，还包括与癌症相关的成纤维细胞（CAF），内皮细胞、间充质干细胞、细胞外基质和基底膜。CAF为上皮细胞提供物理支持，释放各种促进肿瘤的细胞因子和趋化因子（有利于肿瘤生长和血管生成），并且是免疫抑制肿瘤微环境的主要贡献者。重要的是，可以通过结合使用免疫检查点阻滞剂和抗血管生成抑制剂来在治疗上利用抗癌免疫力。因此，有必要确定肿瘤环境的细胞成分并研究它们之间的相互作用最近已发表的一些研究表明，免疫系统的细胞在非淋巴正常组织和肿瘤中起着重要的辅助功能。初始T细胞、效应T细胞、记忆性T细胞以及慢性刺激的功能障碍性T淋巴细胞被认为是主要的T细胞分化状态。共激活受体如CD28、ICOS、OX40、CD40L和CD137，可显著增强TCR依赖性的T细胞活化，而共抑制受体CTLA-4，PD-1，TIGIT的水平升高，LAG3、TIM-3和CD160是进行性T细胞功能障碍和自我更新潜能（衰竭）丧失的重要特征。基于CTLA-4或PD-1开发的抑制剂癌症免疫疗法的成功归因于肿瘤内T细胞衰竭的预防或逆转。在生理条件下，表达大量转录因子Foxp3的调节性T（Treg）细胞减少了效应T细胞和其他免疫细胞类型的活性，在实体瘤中的数量显着增加。这种特异性的抑制细胞谱系被认为在肿瘤进展中起着重要作用，而Treg细胞靶向被认为是一种潜在的肿瘤免疫治疗策略。同样，在与肿瘤相关的巨噬细胞中标准识别了2种主要功能状态：促炎性M1巨噬细胞（其被认为与肿瘤进展相反）和组织修复性M2巨噬细胞（其可促进肿瘤生长和转移）。尽管针对CTLA-4和PD-1的免疫疗法已成功治疗黑色素瘤，肺癌和肾癌，但仅在部分患者和癌症类型中观察到有意义的临床反应。观察到的治疗功效差异与单个肿瘤免疫细胞组成的异质性有关。同样，在乳腺癌中，在肿瘤亚型和患者之间观察到免疫成分的显着异质性。这些发现引起了关于正常和肿瘤组织中免疫细胞状态是否不同以及它们是否代表有限数量的离散分化或激活中间体的疑问。或者，这些细胞状态可占据由肿瘤微环境形成的单个连续光谱。………………（此处可以加入大量免疫微环境研究，包括非编码RNA、蛋白修饰以及一些涉及到测序的大队列样本研究等）Part3. 免疫治疗现状简介和挑战，引出单细胞测序
癌症免疫治疗正在给肿瘤学带来革命性的变化。鉴于在许多晚期和转移性实体癌中成功地实现了长期持久的应答，癌症免疫治疗在基础、转化和临床科学中引起了诸多学术机构的研究热潮。已知目前被招募或正在被招募参与PD-1或PD-L1的患者已达40万明。这些研究活动可能对免疫治疗领域产生重大影响，并为复杂的肿瘤-免疫细胞相互作用提供新的机制见解。然而主要的挑战仍然存在，包括阐明免疫检查点抑制剂治疗的内在和后天耐药机制形成，识别反应的预测标记，确定具有协同潜能的联合治疗的机制基础，识别和选择治疗性癌症疫苗接种的新抗原和CRISPR等基因编辑改造的T细胞过继治疗靶点的确定等。肿瘤和免疫系统相互作用的内在复杂性构成了相当大的挑战，需要全面的方法来询问肿瘤发生和发展过程中的癌症免疫，以及随后的治疗调节。一些已建立的新的高通量技术能够生成必要的数据，从而为机理理解提供基础，并最终增加受益于癌症免疫治疗的患者数量。二代测序（NGS）技术不仅为免疫学研究提供了可挖掘的大量数据，而且越来越多地被真实应用于临床，为癌症治疗提供强有力的信息。此外，诸如单细胞RNA测序（scRNA-seq）等新技术已经成熟，首次能够在单细胞水平上精确描述分子过程。显然，单细胞测序正在发挥越来越重要的作用。 ………………（此处可加入一些免疫治疗相关研究）Part4. 单细胞测序简介以及相应研究罗列
尽管混池转录组（也叫Bulk RNA-seq）的数据只能针对整体的细胞或组织中的mRNA进行分析，但新的scRNA seq技术可用于重建单个细胞的转录组，为研究免疫系统的异质性、可塑性和功能多样性开辟了新的途径。大多数捕获单个细胞的技术都基于免疫磁珠富集、平板的微孔捕获或毛细管流式细胞仪等。接下来分选出的细胞使用如Smart-seq2等，将单细胞中的转录产物进行反转录。但是这些技术也存在诸如通量低成本高等缺点。所以在基于微流控技术的平台上，10X Genomics和BD公司都相应开发了高通量单细胞测序平台。其中基于10X Genomics公司的Chromium芯片，可以针对单个细胞进行捕获并生成相应的油包水结构（GEM），每个GEM包含一个单细胞，以及一个条形码的液滴和下游反应所需的扩增引物、酶和其他试剂，能够同时对几千个细胞进行扩增和测序。大大降低单个细胞转录组的测序成本。目前已有部分研究使用了高通量单细胞测序技术对驻留于肿瘤组织中的免疫细胞进行单细胞转录组测序，如已有文章报道了对肺腺癌和透明细胞肾细胞癌中人类免疫细胞的最新研究，这些研究主要还是构建了肿瘤组织中免疫细胞的类型和组成。另外还有一些课题组还对scRNA-seq分析方法做进一步改良，已开始探索肿瘤中免疫细胞亚群的更精细定义，但无论是样本数量和细胞类型仍然规模有限。 …………（此处可以加入大量已有单细胞研究成果）Part5. 课题组已有研究成果和拟解决问题
前期，课题组已经通过Cibersort反卷积分析，针对常规乳腺癌样本中的免疫细胞类群进行了分析。因此，我们试图对各种类型的人类乳腺肿瘤以及成对的正常乳腺组织，外周血和淋巴结中的造血起源细胞进行大规模数据分析。我们的分析结果表明，淋巴样和髓样细胞谱系的肿瘤内细胞的异质性均显着增加，与正常乳腺组织相比，占据了显着增加的表型空间。这种异质性通过反映对各种环境刺激的反应的基因的组合显著表达。后期我们将通过对更多乳腺癌临床样本的转录组测序以及VDJ免疫组测序，勾勒出T细胞的TCR图谱，TCR特异性决定了这种异质性。 ……………………（已加入自己课题组前期的预实验。包括已有数据挖掘，普通转录组测序数据。有条件可以加入一些生化实验如WB、细胞模型等实验结果）
辅助材料————立项依据与研究内容传统标书参照模板：
XXX简介及其研究进展或存在临床问题
XXXX疾病（XXXXXX，XXX英文名称）是XXX系统(消化、呼吸、神经等等)常见的一种疾病类型，多数是由于XXXX出现功能紊乱以及XXXX功能失调等所诱发，主要表现为XXXX（临床症状或者临床特征），致使XXX组织或者器官发生XXXX等症状，可以引起XXXX、XXXX以及XXXX等严重后果。同时，XXXX（该疾病）也是导致其他类XXXX相关疾病的主要原因之一。目前的研究表明，XXX疾病主要是由于XXXX所引起的（或者说跟XXX有关，也可以说关于该疾病的发病机制还没有研究清楚），对于该疾病的治疗，目前尚没有有效的治疗方法或者药物（或者目前已有药物有哪些不足，存在哪些问题）。近年来，随着xxxx的改变，我国XXX疾病的发病率呈现逐年上升且年轻化的趋势。大量的基础和临床研究表明，导致XXX疾病的危险因素主要包括：XXXXXX等。其中XXX的失调/XXX功能紊乱/XXXX异常等是引起该疾病的主要原因所在。所以，调节XXXX方面的功能是目前治疗和预防XXXX疾病发生和发展的主要关注途径。如针对XXX疾病主要动因的药物羟XXXX、XXXX以及XXXX等已经逐渐成为该疾病的主要药物。但是该类药物目前存在XXXX方面的缺点（成本高、副作用大等等），所以开发新的治疗该类疾病的靶向药物显得至关重要。注：该部分主要内容是提出临床问题，可以是某一个疾病、或者某一个疾病过程中的一个问题等等，所以该段最好按照以下顺序来写：
① 临床现象——某某疾病是怎么回事（疾病简介），或者在某疾病的治疗或者发生、发展过程中观察到的某个临床现象。② 该临床现象的症状、危害及严重性——主要描述该临床现象（一般是某种疾病）的临床症状、严重程度、危害性或严重性等。③ 提出临床问题——即在目前某种临床现象（疾病）存在哪些不足或者未解决的问题急需解决。XXXX分子及其介导的信号通路在XXX疾病中的作用
已有的研究的发现，XXXXX分子及其所介导的XXX信号通路在XXX疾病发生和发展的过程中发挥着非常关键的作用。（接下来主要介绍该分子及信号通路在该疾病发生过程中的作用，可以通过相关的综述来写）XXX分子是一个XXXX家族的蛋白，主要功能是XXX，主要介导XXX信号通路等，研究证明XXX在XXXX过程中有作用。（大概一两百字介绍该分子）XXX信号通路是什么，怎么传导，下游激活哪些基因表达，在XXX疾病或者临床问题中是否有过研究。如果有过研究，详细说明以往的研究证明XXXX信号通路是如何参与该疾病的发生过程的。因此，提示我们XXXX可能在XXX疾病过程中发挥着重要作用/可能是XXX临床问题产生的关键机制所在等。注：该部分内容主要是叙述你的研究将要涉及到的分子或者信号通路，比如某一个microRNA或者某条关键信号通路等，这里的介绍一定要是跟自己项目研究的内容是相关的，尽量详细介绍。
XXXX分子可能通过XXX通路进而在XXX疾病过程中发挥作用
首先介绍自己的研究基础工作我们前期的研究发现：XXXX在XX疾病中具有什么作用。（这里可以使用条目列出自己前期的研究成果）其次根据自己的研究成果提出科学假说根据我们前期的研究工作，我们认为：XXXX（提出自己的工作假说）。我们发现XXX分子在XXX中具有明确的功能，可能是这一临床问题的关键所在，然而其发挥作用的内在机制尚不清晰。所以，我们提出以下假说：XXXXX在某某疾病的过程中，通过作用于XXXX/表达上调/表达下调等等方式，激活XXXX信号通路，调控XXXX细胞功能，最终对某某疾病起到保护或者促进的作用。注：这里重点介绍自己前期的工作基础及研究结果，并最后根据自己的研究结果提出一个科学假说。
概括研究内容及研究价值
在我们前期研究工作的基础上，本项目拟通过XXXX的方法/方式/手段，明确/阐明/验证XXXX，为进一步理解XXXX以及XXXX疾病的药物治疗（药物开发、靶点选择）提供了理论依据（靶点、候选等）。注：该部分主要内容就是概述自己研究的主要内容，最终可能得出的结果，以及研究的意义和价值等。最后，强烈推荐你阅读我们首发的《单细胞测序工具书》，你需要的国自然单细胞项目申请材料统统都在这本书里。
多篇单细胞测序文章助力新型冠状病毒感染、传播机制研究 | 单细胞专题
2019国自然整体情况 | 单细胞专题之国基金
国自然单细胞项目申请 | 你的摘要够好吗？
2020国自然单细胞项目申请——你的学科代码申请对了吗? | 单细胞专题之国基金
国家自然科学基金项目指南重点解读 | 单细胞专题之国基金
国自然申请注意事项 | 单细胞专题之国基金
PBMC单细胞研究汇总 | 单细胞专题