对于第一次做单细胞的老师来讲，拿到单细胞转录组分析报告和结果后，可能面临两大难题：一是如何快速理解结果的意义，二是如何进一步对数据结果进行挖掘。别着急，通过此文我们来一一梳理单细胞转录组常见的分析套路，助力您的文章发表。1结果解读对于基本分析结果图表的意义理解，我司已经录制了单细胞转录组报告解读视频（您可以登录我们的云平台-https://www.lc-bio.cn进行学习，具体步骤如下：），助您快速掌握您项目分析结果情况。2单细胞转录组数据挖掘分析思路1）细胞鉴定对于单细胞转录组第一步也是最最重要的一步就是细胞鉴定，分析结果中的细胞聚类结果cluster0、cluster1，……clusterN是基于细胞基因表达谱获得。我们需要根据细胞特异性marker基因（marker基因的选择可参考数据库：CellMarker：单细胞转录组测序定义细胞群体之利器）对获得的cluster进行细胞类别的鉴定（细胞鉴定方法：手把手教你用Marker基因定义细胞亚群），细胞鉴定的准确性将直接影响后续的一系列分析结果。基于特异性marker基因tsne表达图（下图为各类细胞特异marker基因在细胞中的表达情况，灰色表示该基因低表达，红色表示该基因高表达），可以获得细胞鉴定结果（下图按照Cell type着色，图片来源-文献【1】）：2）感兴趣细胞类群亚群细化对每个cluster细胞鉴定完成后，还可以对感兴趣的细胞进一步做类型细分，分析各个小亚群细胞差异及研究小亚群在生物学过程中参与的功能。比如上图鉴定结果中的1592个内皮细胞可以分为6个sub-clusters，24911个T细胞可以细分为9个sub-clusters，并根据marker基因将这些sub-clusters分配给已知的内皮/T细胞类型进行更深入的研究（图片来源-文献【1】）。 3）两种不同cluster/细胞或两种不同处理间差异比较在进行单细胞差异分析时，一般采用的策略是目标cluster与其他所有cluster细胞间进行差异分析，但在实际研究中，往往需要研究某两类cluster或某两类细胞之间的差异，或者是某一类细胞在不同处理样本间的差异基因情况，因此需要将待比较的cluster提取出来单独进行分析。如文献【2】中，骨髓来源内皮细胞（BMEC）可以细分为3个不同的细胞sub-clusters：动脉血管内皮细胞（Arterial BMECs）、小动脉血管内皮细胞（Arteriolar BMECs，aBMECs）和窦状血管内皮细胞（sinusoidal BMECs，sBMECs）。对动脉血管内皮细胞和小动脉血管内皮细胞进行差异基因分析，发现两个cluster间具有不同的的基因表达模式（下图左显示两个cluster间显著性差异基因火山图），说明动脉血管内皮细胞可能是BMEC的一个特殊亚群。同样在文献【3】中，通过对两种不同T细胞之间进行差异基因分析，可以明显看到两种T细胞亚群之间的基因表达差异（下图右）。4）拟时序分析拟时序分析也称为轨迹分析，最开始拿到的单细胞转录组测序数据，并未直接告诉我们每一个细胞处在什么状态下，因此需要借助一些分析方法来实现轨迹上的排序，以推算潜在的细胞之间的演化关系。拟时序分析方法思路及图表意义请参考：10X单细胞转录组个性化分析-拟时序分析。对不同发育时期小鼠SSC（spermatogenic stem cell，精原干细胞）细胞进行拟时序分析获得的结果与发育的年龄是一致的（下图左），并确定了4种主要的基因表达动力学模式（下图右，参考文献【4】）。当然，除了以上4种常见的分析套路外，还可以根据自身的研究目的选择细胞周期分析，细胞间的互作分析，单细胞CNV分析，RNA速率分析、WGCNA分析等诸多个性化分析。最后，再强调一遍，细胞鉴定对整个单细胞转录组的研究是至关重要的，因此，建议在前期课题设计时应尽可能多的收集组织中相关细胞类别，以及各细胞特异性marker基因。【相关参考文献】：【1】Lambrechts, Diether, et al. "Phenotype molding of stromal cells in the lung tumor microenvironment." Nature medicine 24.8 (2018): 1277-1289.【2】Baryawno, Ninib, et al. "A cellular taxonomy of the bone marrow stroma in homeostasis and leukemia." Cell 177.7 (2019): 1915-1932.【3】Zhang, Lei, et al. "Lineage tracking reveals dynamic relationships of T cells in colorectal cancer." Nature 564.7735 (2018): 268-272.【4】Law, Nathan C., Melissa J. Oatley, and Jon M. Oatley. "Developmental kinetics and transcriptome dynamics of stem cell specification in the spermatogenic lineage." Nature communications 10.1 (2019): 1-14.相关阅读